胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

发布时间:2021-11-27 13:47:20

广州医学院 硕士学位论文 胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究 姓名:黄盛昌 申请学位级别:硕士 专业:免疫学 指导教师:孙筱放 20090501

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

硕士研究生:黄盛昌

指导老师:孙筱放教授、高绍荣研究员

中文摘要

第一部分小鼠胚胎干细胞建系及人孤雌胚胎干细胞的培养鉴定

第一章

小鼠胚胎干细胞建系

研究目的 建立小鼠胚胎干细胞系,为下一步造血分化提供原材料。 材料与方法 1.使用129/sv雌鼠和OG2公鼠进行建系。0(32小鼠的特点是基因Oct4后溶合了 基因GFP,所以在ES细胞在未分化的情况下能够发出绿色荧光。 2.建系方法与常规建系过程一样:取第3.5天孕鼠子宫,冲洗子宫获得囊胚,并 接种到饲养层上;第4-6天后挑取克隆消化传代。 结果 我们将见栓后第3.5天的3只129/sv小鼠处死,取出子宫,冲洗后获得16个 胚胎,其中囊胚有9个,桑椹胚有5个,质量比较差的胚胎(出现较多的碎片) 有2个。由囊胚发育而来的成功建起2株细胞系,建系率为22%:桑椹胚的没有 成功建起细胞系。最后对其中一株细胞系进行鉴定,结果都符合Es细胞的特性 结论 我们建立的小鼠胚胎干细胞系符合ES细胞的特性,具有自我更新以及多向分化 的潜能。 关键词:胚胎干细胞建系;0(32小鼠


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第二章

人孤雌胚胎干细胞的培养以及鉴定

研究目的 通过对人孤雌胚胎干细胞(phES cell)进行培养鉴定,掌握人胚胎干细胞培养技 能,同时了解人孤雌胚胎干细胞的一些生物学特性。 材料与方法 1.由广州医学院第三附属医院妇研所提供的人孤雌胚胎干细胞系。 2.传代方法:使用胶原酶消化法和机械法。胶原酶消化法适合培养皿中克隆生长 比较旺盛,状态比较好的情况下;机械法适合于培养皿中分化细胞比较多,或 克隆比较少的情况。 3.我们对phES细胞进行了Oct4、
SSEA-2、SSEA4、TRA-1-60、T砒■l-81:EB

形成试验;核型分析;STR以及畸胎瘤进行检测。 结果 细胞能表达Oct4、SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1—81等指标;能够形成 EB;核型为45,X0;STR检测显示与供者一致;畸胎瘤到目前还没有检测出来。 结论 phES细胞的培养条件与正常人的ES细胞没有明显区别;通过检测其生物学特 性,发现这株细胞的核型异常,而且致瘤性不强。 关键词:人孤雌胚胎干细胞;STR

第二部分胚胎干细胞的造血分化

第一章核移植小鼠胚胎干细胞的造血分化潜能

研究目的 对核移植来源的小鼠胚胎干细胞(NT-ES)进行造血分化,探讨它的造血分化 潜能。



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材料与方法 1.F-ES细胞来源于129/sv雌鼠与OG2雄鼠交配见栓后第3.5天的囊胚,建系后 稳定传代到第18代时进行实验;NT-ES细胞来源于129/0G2小鼠睾丸的一种 滋养细胞(Sertoli Cell)进行核移植后建系获得,同样取第18代细胞进行 实验。 2.分化过程中,采用预分化一初步分化一进一步分化的步骤进行造血分化。通 过对分化过程中各项指标进行比较,来说明两者的异同。 3.造血移植:检测由这两株细胞分化而来的造血干细胞在体内是否具有造血潜 能。 结果 1.EB形成能力:NT-ES和F-ES在总EB和造血EB形成的数目分别是:129、134
和73、78。

2.流式细胞仪分析结果:在分化的第5、7、10天,NT-ES细胞分化成CD34和Sca-I 双阳性细胞的比例分别为:6.58%、32.03%、23.44%;F-ES细胞的比例分别为:
i0.35%、32.88%、16.54%。 3.Realtime

PCR检测显示,多个造血相关基因在两者分化过程中的变化趋势基本

一致。 4.BL-CFC试验显示,NT-ES细胞能够形成爆发集落。 6.造血移植检测结果显示:两者在体内都能够发生造血。 结论 核移植来源的与受精来源的小鼠胚胎干细胞在体内外几乎具有一样的造血分化 潜能。 关键词:胚胎干细胞;核移植;拟胚体:造血分化;



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第二章初步探讨B]dP4对人类胚胎干细胞造血分化的影响

研究目的 初步探讨Bmp4在人类胚胎干细胞造血分化过程中的作用。为造血移植提供参 考信息。 材料与方法 1.由广州医学院第三附属医院妇研所提供的hESl细胞株。 2.实验分成3组:control组(只添加分化基础培养基)、cytokine组(添加常 规细胞因子)、Bmp4组(常规细胞因子+Bmp4),采用机械法进行接种。将切成块 状的克隆切片接种到超低吸附培养皿中(6孔板),每孔大概接种15-20块克隆 切片。 3.同时采用酶消化法与机械法进行形态学的比较,看两者在EB的发育上是否有
区别。

结果 1.流式细胞仪分析显示,control组、cytokine组和Bmp4组分化至第12天时, CD34+CD38一细胞的比例分别为1.63%、4.77%、9.83%;CD34+CD38+细胞的比例分 别为1.48%、2.13%、2.80%;CD34'CDll7+细胞的比例分别为3.09%、4.40%和9.91%。 2.control组、cytokine组和Bmp4组的造血集落形成数目分别为8、26、35. 3.用机械法处理后接种形成的EB,形态典型而且发育良好;酶消化法处理克隆后, 不易于形成EB。 结论 1、Bmp4能够显示促进hES细胞的造血分化活性。 2、在hES细胞形成EB的过程中,机械法比酶消化法更有利于EB的形成。 关键词:BMP4;人类胚胎干细胞;造血分化



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The Establishment of Embryonic Stem Cells and the Studies of Hematopoietic Differentiation to ES cells

M.D

Candidate:Shengchang Huang

Supervisor:Prof.Xiaofang Sun

Abstract

Part I:the Etablishment of Mouse

Embryonic Stem

Cell and

the

Characteristics of Human Parthenogenetic Embryonic Stem Cell

Chapter I:the Etablishment of

Mouse Embryonic Stem

Cell

【Objective】
To establish mouse embryonic stern cells for the further hematopoietic differentiation.

[Materials

and

methods】

1.We used the mice of 129/sv(female)and
stem

OG2(male)to

establish fertilized embryomc

cells(F-ES).NT-ES

cell was derived from the testicular sertoli cells from donor nuclei for SCNT.The characteristic of OG2 mouse

1290G2Fl

mice

used

as

is that the gene ofOa4 fuses with the gene ofGFP.

2.We

BSe

the regulatory method

to establish the cell line:obtained the dpc3.5 mice,
on

washed the uteruses and got the embryos,plated them after 4-6 days culture.

the feeder layer,passage

【Result]
We obtained
16

embryos

from 3 mice of dpc3.5,including 9 blastoeysts,5 morulas,2
none

bad embryos.At last,we got 2 cell lines from the blastocysts,and identified
one

of others.We

of the two cell lines and found

out

that the cell line consistented

completely with characteristics of embryonic stem cells.



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.一一一

堕堕王塑塾壅墨墨堕璺坌!兰堂堂箜里窒

【Conclusion]



The ES cell line we established is consistent completely with characteristics ofES cells.

【Key words】Embryonic

stem cell;19(32 mouse

of human parthenogenetic embryonic stem cell Chapter H:the characteristics

[Objective】
of human parthenogenetic embryonic Through the identification ofthe characteristics stem cell,we obtain the techniques of hES cell culture and learn some characteristics of

phES

cell.

【Materials and methods】
1.The pilES cell was offered by the third affiliated hospital of college. 2.The methods ofpassage we used:mechanical method and trypsinization?

Guangzhou

medical

3.W奄tegted the markers of Oct4,SSEA-2,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1?81 and
performed the tests of EB formation,karyotype analysis,STR and teratoma

formation. [Result]

1.The phES

cell line can express all the markers

ofOct4,SSEA-2,SSEA^TRAl-60,

T胁l-81
2.It
Call

form EB.Karyotype is 45,X0

and

the loci tested by STR is consistent

completely with the donon

3.We have repeated the teratoma testing

3 times and the testing is still negative?

【Conclusion】
The phES cell line culture method is consistent with the hES cell line.The

teratoma testing. characteristics of phES cell line is abnormal at the karyotype and

[Key words]Human parthenogenetic

embryonic stem cell;STR



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PartⅡ:Hematopoietic

Differentiation ofES Cells

Chapter h

Hematopoietic Differentiation
Cells

of NuclearTransfer

Embryomc Stem

【Objective】
To study the hematopoietic potential of NT-ES cells.

【Materials and methods】

l。低NT-ES

and F?ES cell lines were offered

by

national institute of biological

sciences,Beijing.Both
after passage to 1 8. 2.11舱steps of

of the cell lines were used to hematopoietic differentiation

hematopoietic

differentiation

was

predifferentiatioll’primary

differentiation and secondary differentiatiort We campaled the characterization of NT-ES and F-ES cell lines during the process. 3.Tranplantation:to test whether the hematopoietic stem cells and F-ES cells had the hematopoietic potential in vivo.

d嘶ved

from NT-ES

【Result]
1.11舱total EBs of NT-ES and F-ES themare73 and78.
2.
al e

1 29 and 1 34;The total hematopoietic EBs of

wc tested the double positive cells of CD34 and Sea-1 by FACS.The rates ofNT.ES
ale

6.58%、32.03%、23.44%,and F-ES cells

afe

10.35%、32.88%、16.54%

respectively tested at EB-day5,EB-day7 and

EB?myl O。

3.11怆result of Realtime PCR showed NT-ES and F.ES cells almost had same trend during the hematopoietic differenfiation.
4.

ne

total

colonies玳37 and 32 ofNT-ES and F—ES in BL_cFc assay.
and F-ES
showed positive in hematopoietic tramplantation.

5.Both ofthe NT-ES

【Conclusion]
NT-ES and F-ES cell lines have almost same hematopoietic potential in vitro and in vivo.

【Key words】NT-ES;Hematopoietic Differentiation;EB;Transplantation


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ChapterIh

Initially Studying the Role of

BMP4

to Hematopoietic

Differentiation of Human Embryonic Stem Cell

【Obj ective】
To study the role of BMP4 to the Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells,and offer some useful information to the hematopoietic human.

transplantation

of

【Materials and methods】
1.The hES 1 cell line was offered by the third affiliated hospital of Guangzhou medical college.

2.The

experiments

were

divided

into

39roups:control(without

cytokines),

cytokine(adding routine cytokines)and Bmp4(Bmp4+routine cytokines). 3.We
compared the difference in
EB

formation

by

mechanical

method

and

trypsinization.

【Result]
1.At EB—dayl2,We tested the markers

OfCD34,CDl 17

and C38 by FACS.The rates of

CD34+CD38"are 1.63%、4.77%、9.83%respectivelyto control,cytokine and Bmp4 group;The
rates

of CD34+CD38+are

1.48%、2.13%、2.80%:The

rates

of

CD34+CDI 17+are 3.09%,4.400/o,9.91%respectively.

2.The

total

colonies

are 8,26 and 3 5 respectively to control,cytokine and Bmp4 group


in CFC assay.The result of Realtime PCR showed EG.GFP+cell was active than EG-GFP。cells during the hematopoietic differentiation.

little more

3.Mechanical method was better than trypsinization in

EB formation.

【Conclusion]
I.Bmp4 call

enhance the

hematopoietic potential ofhES cell obviously.

2.Mechanical method 瞰ey words】Human

was better than trypsinization in EB formation.

Embryonic Stem Cell;Hematopoietic Differemiation;EB;Bmp4

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学位论文原创性声明

本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。文 中依法引用他人的成果、对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中做出明确标注或得到许 可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请 的论文或成果。 本人如违反上述声明,愿意承担以下责任和后果: 1.交回学校授予的学位证书; 2.学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报;

3.本人按照学校规定的方式,对因不当取得学位给学校造成的名誉损害,进行公开道歉。
4.本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。

论文作者签名:

日期:兰竺2年』月_L日 日期:兰竺兰年—鱼月——L日
学位论文知识产权权属声明

本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属广州医学院及附属单位。广州医 学院及附属单位享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,署名单位仍然为广州医学院及附属单位。任何 其他收存和保管本论文的单位和个入,未经本论文作者、导师授权,不得将本论文转借他人、复制、抄 录或以其他任何方式传播,否则,引起有碍作者的著作权益问题,将会追究相应的法律责任。

论文作者签名.蔓进墨

日期:丝年二月』 日期:2丛年』月』E1 导师签名:盈:钮谚吼鲤L年上月』日
关于学位论文使用授权的说明
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论文作者签名:

日期:止』月上日
日期:丛灿上月上日
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学位论文作者签名:

日期:2008年12月



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早在第二次世界大战期间,美国在日本广岛和长崎投放了两枚原子弹,造成数 以百万的*民遭受大剂量的辐射。当时,医学家尝试用骨髓移植的办法来治疗骨 髓系统受到严重抑制的患者,结果收到了明显的效果。尽管如此,由于存在排斥 反应,骨髓移植还是受到了很大的限制。 不过,胚胎干细胞(Embryonic
stem

cell,ESCs)给骨髓移植带来了新的希望。

从1981年第一株小鼠胚胎于细胞成功建系[1],以及1998年第一株人类胚胎干细胞 (}lEsCs)成功建系[2]到现在,胚胎千细胞的研究已经经历了27个年头。一直到现 在科学家们仍然坚持不懈地探讨和研究胚胎干细胞,胚胎干细胞究竟给我们人类 带来了什么呢?答案很简单,胚胎干细胞给我们带来的是希望,科学家们正是朝 着这个希望不断地努力。胚胎干细胞由于具有无限增殖以及多向分化的潜能[3], 它给人类带来了治疗多种疾病的可能性,正因为如此,第一株人类胚胎干细胞的 成功建系就具有划时代的意义了。在体外利用胚胎干细胞定向分化为需要的造血 细胞,然后经过骨髓移植给特定的病人,从而达到治疗各种*疾病的目的。2006 年Yamanaka和Jaenisch等[4,5]先后发表了关于利用成体成纤维细胞诱导成胚 胎干细胞的报道,使胚胎干细胞的发展掀起了另一个高潮。此外,利用胚胎干细 胞进行定向分化的研究很多,目前研究比较多的还包括向神经细胞、心肌细胞、 胰岛细胞、血管内皮细胞E6-13]等的定向分化。 一、人孤雌胚胎干细胞的发展现状 目前,已经有很多关于各种胚胎干细胞的报道,但是关于人孤雌胚胎干细胞的 报道在*这几年才出现,说明人孤雌胚胎干细胞的建系方法还不是很完善。 2007年,Kim等[14.15]在进行体细胞核移植(somatic
cell nuclear

transfer,SCNT)过程中获得一株细胞株,通过SNP鉴定后确定为一株人的孤雌胚 胎干细胞。Mai等[16]报道,在他们建立的两株phES细胞中,其中一株为正常核 型,能够表现正常的生物学特性;而另一株在长期传代过程中产生了染色体易位 现象,并且不能长出畸胎瘤。提示异常核型的phES细胞分化能力比较弱。 二、小鼠胚胎干细胞造血分化的研究现状 1985年,Doetschman等[17]在小鼠Es细胞形成的拟胚体(embryoid
bodies,

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胚胎于细胞建系及造血分化潜能的研究

EBs)中发现有类似胚胎发育中卵黄囊血岛样的结构,随后许多实验室相继报道了 ES细胞在体外分化为红细胞、髓细胞和淋巴细胞等一系列造血细胞。表明在合适 的条件下,ES细胞是可以分化为造血细胞的。1993年,Keller等[z83利用129/sv来 源的胚胎干细胞进行了最早的造血分化研究,当时他们利用两步法进行分化,即 先形成拟胚体,然后再添加常规细胞因子进一步分化,而且成功分化出多种永久 造血细胞。随后,瑞典一位学者Palacios[19]利用胚胎干细胞分化出造血干细胞, 将之前的分化提升到一个多能性的水*。 *年来,不少学者研究发现,通过上调某些基因的表达,能够促进中胚层发育, 同时进一步促进造血分化。目前研究发现有多个基因对Es细胞的造血发育都有影 响。敲除胚胎干细胞中Wnt2基因后,发现拟胚体中F1k-i+细胞形成增多,但这种 增多只是促进了造血的发育,上皮细胞和心肌的分化都受到了抑制[20]。Pfendler 和Takenaga等[21,22]通过对Nodal基因进行过表达,发现过表达后这一基因明显 促进了拟胚体中胚层和内胚层的发育,同时抑制了外胚层的表达。此外,上调基 因Runxl、Hoxb4、Gatal、Gata2、StatSa[23-27]等,以及下调基因S舱d5[28]的 表达水*也能显著提高造血活性。 Bmp和Wnt信号旁路调控是目前对胚胎干细胞造血调控研究比较多的信号通路。 Claudia和Daley等[29]在研究斑马鱼体外造血分化时。认为拟胚体形成过程中, BMP4能够激活Wnt3a和上调Cdx和Hox基因,诱导腹侧后面中胚层的形成,进一 步促进中胚层直接向造血细胞分化。此外,Wnt信号能够协助Bmp的诱导作用,Wnt 效应因子LEFI也能够调节Bmp4对Cdx基因的激活。Naito等[30]发现,对Wnt/ B-catenin信号旁路途径进行激活后,在拟胚体形成的早期阶段,能够促进ES细 胞向心肌的分化,抑制了向造血和血管前体细胞方向的分化;在拟胚体形成的后 期阶段进行诱导分化时,发现心肌的分化受到抑制,而向造血和血管前体细胞方 向的分化水*却有明显的提高,提示Wnt/B—catenin信号旁路在诱导分化过程中 的不同发育阶段存在双重调控的作用。 多年来,小鼠胚胎干细胞造血分化的培养途径主要通过与基质细胞(如OP9、¥17、 C166等)共培养[31],或通过形成拟胚体(Embryoid body,EB)[32]途径进行。 由于拟胚体培养操作简单,而且减少了动物源性的污染,因而被广泛应用。培养 方法主要采用两步法,即先形成拟胚体(大概需要7天左右),然后再添加常规造 血细胞因子[18];也可以使用第3.5的拟胚体,重新接种后形成爆发集落[33]。
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目前,对于分化出来的造血干细胞的鉴定方法,金标准是能够在体内实现造血 重建。*几年来利用胚胎干细胞来源的造血干细胞在体内实现重建造血的报道非 常少。Tsukasa Miyagi等使用分化出来的flk一1+细胞进行了造血重建[34],移植后 在第一代小鼠体内能够长期造血;Schuringa等[35]通过上调基因StatSa,使分化 出来的造血干细胞能在第一代移植的小鼠体内存活,提示上调基因Stat5a可以使 胚胎干细胞不断形成造血干细胞,或者能使造血干细胞的寿命延长。由胚胎干细 胞来源的造血干细胞,可能存在着某些功能的缺陷,或可能它的归巢能力比正常 骨髓里造血干细胞差,导致他的重建造血能力丧失或降低。 三、人类胚胎干细胞造血分化的研究现状 自Thomson在1998年将第一株人类胚胎干(hES)细胞成功建立起来后,学者们 就已经开始利用人胚胎干细胞进行造血分化了。目前利用人胚胎干细胞进行造血 分化的方法与小鼠的相似,也是利用与基质细胞共培养以及朗途径进行: 1、与基质细胞共培养 2001年,Dan S.Kaufman[38]利用小鼠骨髓基质细胞

S17和卵黄囊内皮细胞C199与胚胎干细胞共培养,培养液里只添加胎牛血清,不 添加外源的细胞因子。在造血集落形成试验里能够长出典型的各系造血细胞集落。 此外,Kaufman等也利用人胎肝基质细胞与hES细胞共培养来研究分化早期血红蛋 白的表达模式[39]。国内Jian Wang等[40]利用人骨髓基质细胞和低浓度的细胞 因子与hES共培养,阐明了常规细胞因子和人骨髓基质细胞对hES细胞的造血分 化作用。Weisel等[41]对AGM基质细胞进行了分析,认为由第10.5天小鼠胚胎来 源的AGM基质细胞能够支持小鼠和hES细胞的造血分化,而且AGM基质细胞能够 用来研究由胚胎干细胞发育而来的中胚层在干细胞早期发育以及造血分化过程中 的分子机制。 2、拟胚体途径
Mickie

Bhatia等[42]在2003年通过形成EB途径进行造血分化,

方法与小鼠的分化有明显的区别:将hES细胞消化以后,先用没有添加细胞因子 的分化基础培养液在超低吸附培养皿悬浮培养24-48小时,然后再更换添加了细 胞因子的培养液进行长期培养。同时他也阐明了Bmp4对hES细胞造血分化的积极 作用。Marjorie Pick等[43]将hES细胞消化处理后,利用促凝集法(将一定量的 细胞接种到超低吸附的96孔板里,然后通过离心将细胞聚集成团)进行培养分化, 形成的髓能够更好地控制数量和大小。 目前,普遍认为人类造血干细胞的表型特征是一群表达

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胚胎千细胞建系厦造m分化潜能的研究

cD341cD381inlⅡ^一DRlrhy—l+c—kit+LFA—I-CD45P,A

CDTl飞hodu]1的少量细胞群体

[44,4s]。Mickie Bhatia在造血分化过程中发现,一群被称为cD45IPFv的细胞群

[46,47],他的表型为CD45不表达,PECAM-I、VE-cadherin和Flk—l都表达的细胞 群。在EB培养过程中,只有表型为上述细胞群时,才能生成造血细胞,同时,它 也能形成血管内皮细胞,类戗于一群成血管枢细胞(见国1)。Shi—Ji曲g h等[48]

通过基因芯片检测发现,胚胎干细胞来源的cD34℃D孵造血细胞与卵黄囊和胎肝
早期发育过程中的主要造血基因的表达相一致,表现出与胚胎基因表达相类似的 一个细胞群,而且比从成体造血组织里分离出来的CD34"CD38。造血细胞更加原始。

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图1 hES细胞造血分化过程示意图来自文献[42]

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图2人类造血细胞分化过程示意图咽片来自Google]

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胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

*年来,关于hES细胞造血分化过程中造血干细胞形成效率问题,Bmp4无疑是
研究最多和效果最好的一个细胞因子。2001年,Kristina Detmer[49]就已经利

用Bmp家族对造血干细胞的造血分化作用进行了全面的分析。他发现,如果在分化 培养液里只添加IL-3和或Epo,Bmp2、4、7这几种细胞因子,对造血集落的形成和 发育没有任何的作用;如果添加了SCF和GM—CSF,他们和Bmps可以起到协同效应; 如果添加GM—CSF和Epo,只有Bmp4才起明显的作用。而且他还对Bmp4作用的最佳浓 度进行了梯度检测,发现Bmp4在浓度为50ng/m1的浓度下,结合常规细胞因子对造 血分化的效果最佳.此外,在造血祖细胞的分化过程中,Bmp4与常规细胞因子结 合能够协同诱导造血干细胞的分化[503。受到成体造血干细胞研究的启发,在胚 胎干细胞的造血分化过程中,Bmp4起着同样明显的作用。Chadwick在2003年就探
讨了Bmp4对hES细胞的作用[42]。他认为,50ng/ml的Bmp4结合常规细胞因子,对 造血分化的效果最好。这与上述Bmp4对成体造血干细胞的作用是一致的。此外,

联合使用VEGF-A165,能够提高CD34、KDR以及红细胞标志物的表达[51]。 Srivastava等[52]提出,TPO作为一种重要的细胞因子能够促进hES细胞的造血作
用。TPO联合VEGF能够起到协同刺激作用,共同促进造血祖细胞的生成。这些细胞 因子的使用,能够使造血分化的效率提高2-3倍,从而为造血移植提供了更大的可 能性。

目前,关于利用hES细胞分化而来的造血干细胞进行造血移植的报道也不多,说
明常规培养方法所得到的造血干细胞存在一定的缺陷。Daisy Narayan等[53]将hES 细胞在S17基质细胞上培养至第17天,然后通过流式细胞仪分选CD34+/Lin一或 CD34+/CD38一细胞,通过胎盘注射到羊胎儿体内。当胎儿出生以后,采集胎儿的外

周血和骨髓,以及将部分骨髓重新接种到另一只羊胎儿体内。通过流式分析以及 PER检测,都能检测出人的造血细胞。最后将骨髓里造血细胞接种至甲基纤维素造
血分化培养基上进行造血集落培养,收集一定量的集落进行STR和PCR检测,检测 结果都为阳性。提示在通过分化生成的人造血干细胞在羊身上能够实现造血移植。

Odorico等[54]在2001年就已经详细阐述了有关hES细胞造血分化的现状。他们指 出,如果要将胚胎干细胞来源的造血干细胞移植到病人体内,必须先检测分化效
率、安全性以及防止免疫排斥反应。同时,关于防止免疫排斥反应,他们也指出 可能进行的方法有:1、对心C基因进行基因操作。可以对hES细胞的MHC基因进行

基因敲除或敲入,达到与供体HLA一致的表型。2、通过核移植方法实现。将受者

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胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

的体细胞通过核移植的方法注进人卵母细胞后,在体外发育成囊胚并建系,然后 分化成造血干细胞,再移植进受者的体内。虽然目前这种方法在人类身上还没有 成功,但经过科学家的不断努力,不排除今后实现的可能性。3、造血嵌合。就是 将分化出来的造血干细胞和由同一种胚胎干细胞分化出来的另一种组织细胞一起 或先后移植到同一受体里。这样可以形成一种造血嵌合,受体也对第二组织产生 免疫耐受。此外,iPS细胞[55-57]是目前实现造血移植最有前景的方法。通过将 病人的皮肤成纤维细胞转化成胚胎干细胞,经过同源重组修复成正常的胚胎干细 胞,然后再分化成造血干细胞移植到病人体内。这种途径既排除了自身免疫排斥
反应,又避免了伦理学的问题,是目前最有应用前景的方法。


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图3 hES细胞造血移植的示意图来自文献[54]

四、本文研究的目的和意义 1.通过掌握小鼠胚胎干细胞建系以及人孤雌胚胎干细胞的培养鉴定,为进一步诱 导分化打下坚实的基础。 2.许多报道阐述了由体细胞核移植来源的克隆小鼠存在许多异常,包括出生率
16

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低、肥胖症、生长过快、某些印记基因异常等[58,59]。这些异常不是来自于 遗传,而是由于核移植操作过程导致的[60-62]。尽管克隆小鼠在外形上正常, 但可能在某些基因的表达上存在异常,这可能是由于错误的遗传重组所导致的 [63—64]。几组实验研究都发现,核移植过程能够影响印记基因如Igf2r、H19、 Meg、Ascl2等的表达[65-67]。此外,基因芯片检测同样表明核移植后存在着 某些异常基因[68]。 虽然核移植可能会给后代带来某些遗传上的异常,但NT-ES细胞(核移植 来源的胚胎干细胞)与F-ES细胞(受精来源的胚胎干细胞)有许多相同的特 性。最*报道称NT—ES细胞在转录上和功能上与F—ES细胞没有明显的区别 [69-70]。目前已经有学者报道了NT-ES细胞在神经细胞的分化潜能上与F-ES 细胞相同[71]。但直到现在,没有关于NT-ES细胞向造血分化方向的报道。 为了阐明NT-ES细胞与F-ES细胞在体内外造血分化潜能上是否有区别,我们 进行了深入的探讨,这对于再生医学的研究提供了一些参考信息。

3、初步探讨Bmp4对人类胚胎干细胞造血分化的影响,为进一步促进人胚胎干细
胞造血分化提供依据。

17

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第一部分小鼠胚胎干细胞建系及人孤雌胚胎干细胞的培养鉴定

第一章小鼠胚胎干细胞建系

研究耳的 建立小鼠胚胎干细胞系,为下一步造血分化提供原材料。 材料 1.小鼠来源 使用的小鼠包括:129/sv雌鼠,6-8周,购自北京维通利华公司;0(32公鼠,6-15 周,购自美国Jackson实验室:SCID小鼠,购自北京维通利华公司。OG2小鼠的 特点在基因Oct4后融合了基因GFP(Oct-GFP),所以ES细胞在未分化阶段能够 发出绿色荧光[72,73]。 2.主要仪器 仪器名称 CO:培养箱 C0:培养箱 荧光显微镜 普通倒置显微镜 -80℃冰箱 液氮罐 普通PCR仪 普通冰箱 水浴锅 3.主要培养试剂 试剂
Knockout D蛐瑚 GIBCO
CHEMI CAN


生产公司
Thermo HERA Olympus Nikon NI渭BRUNSWICK SCIENTIC Barnstead Internat ional
B10-RAD

型号
HEPA class 100 Cell
lX71

150

Eclipse TSl00
U570

LT509X25
PTC-100

E1ectrolux 0AKION

生产公司
10829

货号

D删
KSR

SLM-220一M
1028

GIBco

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Fetal Bovine Serum

HYCLONE CHEMICON CHEMI CON

SH30071.03 TMS—AB-2C
TMS—002一C

Pen/Strep(1 OOX) L—glutamine(IOOX) NEAA(100X)
2-Mercaptoethonal LIF PD
Mitomycin C

CH蕊ICoN CH蕊ICoN cH跚ICoN
PROMEGA Sigama

TMS一001一C ES-007-E ESGll07 V119A M0503

4.主要检测试剂 试剂
Ex Taq Hot

生产公司
Takara INvITRoGEN PROMAGA INVITROGEN Santa Cruz Santa Cruz
Santa Cruz

货号
DRR006B


Start(PCR检测)

总RNA提取试剂盒 eDNA反转录试剂盒
Goat anti rat IgG——PE SSEA——1
rat

12183-018

anti

mouse

SOX2 rat anti Nanog
rat

mouse

anti

mouse

5.ES细胞建系培养液的配制 试剂
DMEM

用量
8iml 15ml iml lml lml lml 10ul lul 100ml ≈80% 15%

终浓度

KSR

Pen/Strep(I OOX) L-glutamine(100K) NEAA(IOOX)

100U/ml(ix) 2mM(1X) 0.1nM(1X) 0.1I枷(1X)


2一姬
LIF PD Total Vol ume

000U/ml

50uM

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6.ES细胞培养液的配制 将上述建系培养液中的KSR换成FBS,其它成份及比例不变。 方法 一、建系 1.MEF的制备(略)

具体步骤详见美国威斯康辛大学Wicell公司网页(垒主主卫;么趣!i旦金!!:Q!g)
2.脏F使用前处理

a.将MEF细胞(<P3)接种至直径为60m的培养皿中培养12-18个小时,镜下观
察细胞密度大概为培养皿面积的80%时,即可以处理。 b.去掉培养液,往培养皿中添加2ml的新鲜培养液,然后再添加丝裂霉素c,将浓 度调整为lOug/ml,培养箱内作用2.5—3个小时. c.去掉上清,用PBS清洗3次,然后0.05%的胰酶消化2—3分钟,用培养液中和后, 将细胞密度调整为1X105个/m1。96孔板中每孔接种50-80ul;35mm的培养皿可 以接种1.5-2ml,接种后镜下观察一下,并根据细胞密度作适当调整。接种前培 养皿先铺上0.1%的明胶,并置于培养箱内孵育30分钟。 d.接种后大概6个小时即可以使用。 3.小鼠囊胚的获取 a.将129/sv雌鼠与OG2公鼠1:1合笼,次日早上检栓,从见栓起算0.5天. b.将见检后第3.6天的小鼠颈椎脱臼处死,取出子宫,并用lml注射器和M2培养 液冲洗,将收集的胚胎置于M2培养液液滴里(^12培养液滴用石蜡油铺盖,用前 先置于培养箱内*衡过夜)。 4。接种 a.先用浓度为0.1%的链蛋白酶处理囊胚透明带5-8分钟,当镜下透明带几乎消失 时,将胚胎转移至预先做好的培养液滴中中和,清洗3次以上。 b.将囊胚接种至准备好的96孔板上,每孔接种1个胚胎。接种前6-8个小时,需 要先将培养液换成建系培养液。 5.传代 a.培养至第4-6天后,镜下挑取长出细胞团的克隆。挑取前先将玻璃毛细管(国 产)在酒精灯下拉取适当大小的孔径,然后接上口吸管操作. b.将细胞团转移至另一个空的96孔板孔中,预先加适量的0.0596的胰酶(约

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30-50u1)作用2分钟左右,然后全部转移至另一个准备好的96孔板的孔中. 这一过程算为第1代。 c.大概培养2-3天后(根据克隆生长状况),进行第2代传代。传代时可以按照ES 细胞的常规传代方法进行,将96孔板中1个孔的细胞传到24孔板的1个孔中。 d.以后传代按照ES细胞常规传代方法进行,传至第3-5代时,根据克隆的生长状 况可以将Es细胞建系培养液更换为Es细胞培养液。 6.ES细胞的冻存 冻存液按ES细胞培养液:FBS..DMSO=5:4:1比例配制,配制好的冻存液置于4℃ 冰箱内预冷(室温下DMSO对细胞的毒性比较大)。将Es细胞消化处理后(步骤如 前述),离心并去掉上清;加入适当的冻存液(一般是每支冻存管用0.8一Iml冻存 液,每个35mm的培养皿冻2管)轻轻吹散过后分装置离心管中;接下来的冻存过程 中,最好是先4"C放置30分钟,然后-204C放置30分钟,一80℃放置244,时后置于液 氮中长期保存(如果时间不允许时,也可以将冻存管直接置于一80℃,244"时后置 于液氮中长期保存)。 7.ES细胞的解冻‘ 先将Es培养液置于37。C水浴锅中水浴5分钟,然后在超净台里吸3-5ml至t]lSml的 离心管中,并将其它需要接种细胞的工具准备好;从液氮罐取出一支Es细胞冻存 管,迅速将冻存管置于37℃水浴锅中来回晃动,直到冰块几乎完全溶解为止,整 个溶解过程尽量不要超过2分钟:然后迅速在超净台里将细胞转移到之前准备好的 15ml离心管中,1000转/分钟,离,b5分钟;去掉上清,加适量的培养液重悬细胞 并接种到准备好的培养皿里培养。 二、鉴定 1.总RNA的提取(Invitrogen kit) a.将细胞收集到离心管中,4℃20009离心5分钟; b.去掉上清,加适量的RNA溶解液(根据说明书确定用量,常为300u1); c.通过涡旋振荡充分混匀,直到细胞团全部散开,并出现细胞溶解; d.加同等量的70%乙醇,充分振荡混匀; e.将上述混合液转到RNA离心管中,室温下120009离心15s;去掉滤液,如果还 有标本剩余,可以重复上述步骤; f.将70ul的DNA酶I buffer与lOul的DNA酶I混合,然后添加至上述离心管中
21

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央,室温放置15min; g.加350ul清洗1液,室温下120009离心15s,去掉虑液;加入500ul清洗1液, 重复上述步骤; h.加500ul清洗2液,室温下120009离心15s,去掉滤液后,重复一次清洗; i.室温下120009离心1分钟,目的是甩干柱子上残留的酒精; J.将柱子转移到RNA收集管中,向管中心加30-100ul的无RNA酶水溶解,室温放 置1分钟。最后120009离心2分钟即可。 k.吸取3ulRNA提取液进行电泳,检测提取的效果:通常只出现2条条带,上面一 条条带(28S)的亮度是下面一条带(18s)的两倍左右,为提取效果比较理想。 2.cDNA的合成:(promaga a.RNA变性条件: 成份
RNA Oligod T18 DEPC H20 Total V01 ume 2ul 1.5ul 1.5ul 5ul kit)

用量

反应条件是65℃5分钟。反应结束后,将反应管置于冰块上5分钟,使RNA完全 成单链状态。 b.RT-PCR反应体系: 成份
5Xbuffer 5ul lul inhibi tot lul
1.25ul

用量

^眦V
RNAse

dNTP
DEPC

H20

11.75ul 5ul 25ul

上述变性RNA液
Total Volume

反应条件是50"C 50分钟,72℃10分钟。eDNA合成完毕以后最好先用管家基因 (如B-actin、gapdh等)进行检测,判断反转录的效果。

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4.RT-PCR所用的引物序列:
Genes 0ct4 Primer sequences

5’。啼3’

劢P
55

Size,bp 125

F:5I-TCACTCAC ATCGCCA—TCA.3’

R:5'-TG髓∞CCrcATACl℃T1℃1℃GT.3’ Sox2 5r-AACCA(℃GC A:rGGACAGC.3’
Y-TCGGACTrGACCACAGAGCC.3’

60

281

Nanog

5I-AGGGC也町℃瑚TGAACG-3’
5+?GAAGTT氏rGGAGCGGAGC-3’ 5’-GGAGCCCAAGCCAAAGAG.3r 5'-C,-GTAGTGCCTGGTCAGTrCAT-3’


52

200

Klf4

57

212

c-Myc

5'-TGI.ATGTGGAGCGGm℃T-3’
5’<℃T^TcGrrGA00GGGl=A.3’
5|.TGCCCAGAAC_虹℃ArCCCT_3’

55

210

GAPDH

55

232

5’.一C}TCCl陀A(订GTAGCCCAAG-3’

使用的试剂为Takara公司的ExTaqHot Start试剂盒,反应体系为: 成份
1 OXbuffer

用量
2ul 1.6ul
met

dNTP Forward pri

0.3ul 0.3ul 0.1ul Iul 14.7ul 20ul

Reverse pri mer Taq Ex Template
dH20

Total Vol ume

反应条件:95℃2min_
4.核型鉴定

95℃

30s一55℃30s_

72℃

30一

72℃lOmin,在反应步骤2和4之间反应35个循环。

a.取处于指数生长期的细胞接种到60ram的培养皿中,3-5天后,当克隆生长面积 达到培养皿面积80%左右时进行下一步处理。 b.向培养液中添加秋水仙素(25ug/m1),使培养液中的浓度为0.25ug/ml,培养箱 内作用4个小时。 C.用0.0596的胰酶消化细胞,收集到离心管中,1000rpm离心5分钟。 d.低渗处理:离心后去上清,加入3-4滴低渗液(O.4%KCL:0.4%柠檬酸钠=1:1,

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用前37℃预热),轻轻弹匀,再加低渗液至lml,37℃温箱内放置5分钟. e.预固定:向细胞悬液中加入固定液(冰醋酸:甲醇=1.3)7滴,弹匀,室温放置 20分钟,然后1000rpm离心5分钟。 f.去上清,向细胞悬液中加入固定液4ml,混匀,室温放置40分钟,然后1000rpm 离心20分钟,去上清。重复一次固定,固定液加2mt,固定20分钟后离心,去 上清,加入固定液3-4滴。 g.制片:从-20℃冰箱中取出冰冷的载玻片,向片的一侧滴2-3滴细胞悬液,滴片 高度大概为0.5米,然后65℃烘箱内烘烤干燥。 h.消化;将烤干的制好的玻片置于消化液中30-40s,取出冲水。消化液的配制: 生理盐水(预温0.5h)5ml+胰酶40mg,水浴30min,再加3%Tris 15滴,混匀。 h.染色: Giemsa原液:PH6.8磷酸缓冲液=1-9混合,然后将染液铺满到载玻片

上,10分钟后用自来水冲洗,干燥后镜检.

5.髓形成试验 将1个35咖的培养皿ES细胞克隆用胰酶消化下来,并转到另一个新的培养皿 内,培养箱内放置30分钟。以除去部分饲养层细胞;然后收集没有贴壁的细胞, 1000rpm离心5分钟,去上清:用无LIF的Es细胞培养液将细胞悬浮起来,种到

lOOm的细菌培养皿中,添加13ml的上述培养液,让ES细胞自发分化。
6.免疫组化检测 a.在35ram培养皿中铺上无菌的盖玻片,可以不接种feeder,然后取生长良好的 ES细胞接种到上面,培养24小时。 b.取下盖玻片,用4%的PFA(多聚甲醛)固定2小时以上(也可以4℃过夜); c.加上0.1%的Triton溶液,作用10分钟,目的是在细胞膜上打孔; d.用DPBS连续洗3次,每次15分钟,室温操作即可; e.封闭:加上5%的BSA,培养箱内孵育30分钟; f.用1%BSA将SSFA-1、SOX2和Nanog 1抗体(rat 滴加到细胞上,培养箱内孵育2个小时; g.用DPBS连续洗3次,每次15分钟: h.用1%BSA将二抗(goat
anti

anti

mOtlSe)1:500稀释后,

rat,发射波长为546nm)1:300稀释后,滴加到

细胞上,培养箱内孵育2个小时,或4℃过夜;

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i.用DPBS连续洗2次,每次15分钟; J.加入DAPI(1:10)稀释,室温孵育10分钟; k.用DPBS清洗1次,室温15分钟; 1.封片,共聚焦荧光显微镜观察。 7.畸胎瘤检测

收集一个60m培养皿的Es细胞(生长密度>8096),将细胞悬液调整在0.2-0.3ml,
然后用lml的注射器注射到Scid小鼠腹股沟皮下。观察畸胎瘤的生长情况,第20 天后处死小鼠取出畸胎瘤,进行病理切片。 8.嵌合体小鼠 a.将129/sv雌鼠通过促排卵后,与OG2公鼠合笼,于见栓后第3.6天取出子宫, 冲洗并获得囊胚。 b.将Es细胞处理成单个细胞,并通过囊胚注射注射进囊胚内,过1--2小时后进 行受体移植。 c.受体选取ICR小鼠。将ICR雌鼠与ICR结扎公鼠合笼见栓后,于第3.5天作为 受体。

结果 1.建系情况 我们将见栓后第3.5天的3只129/sv小鼠处死,冲洗子宫后获得16枚胚胎, 其中囊胚有9个,桑椹胚有5个,质量比较差的胚胎(出现较多的碎片)有2个 (详见表1)。 总个数 囊胚 桑椹胚
废胚
9 5 2

贴壁率
9(100%) 4(80%) O(0%)

建系率
2(22%)
O O

表l 129/0G2 ES细胞建系情况 2.全能性鉴定(挑取其中1株细胞系进行检测,并命名为F-ES) a.镜下形态 由于OG2小鼠的基因Oct4融合了基因GFP,所以ES细胞在未分化

阶段能够发出绿色荧光(见图1)。目前,建立的细胞系已经传至20代以上。

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b.RT-PCR结果显示,F-ES与一同鉴定的NT-ES细胞都能够强表达0ct4、Sox2、 Nanog、K1F4、c一坶c等全能性基因(见图2)。 c.免疫组化检测 结果显示,F-ES细胞能够在蛋白水*表达SSEAl、SOX2以及

Nanog(见图3)。 d.核型分析:计数20个核型后,有70%以上的核型都为40条染色体. e.形成EB图4是通过悬液培养至第16天的EB。 f.畸胎瘤检测注进Scid小鼠体内的Es细胞能够长出畸胎瘤,并且病理切片结 果显示能够分化成内中外3个胚层(见图5). g.F-ES细胞不但能够形成嵌合体小鼠,而且在嵌合体小鼠所生的小鼠中,出现毛 发纯黑的小鼠,说明基因组已经整合到基因组中,是F-ES细胞具有高度全能 性的表现(见图6)。 从上述鉴定结果可以基本说明,我们所建立的F-ES细胞系具有自我更新以及 多向分化的潜能,符合胚胎干细胞所应具有的基本特性。

讨论

我们所使用的小鼠刈G2小鼠,由于在基因Oct4后溶合了基因GFP,所以ES

细胞在未分化阶段能够发出绿色荧光。根据这一特点.对于我们判断ES细胞是否 发生了分化具有参考作用。我们建立这一细胞株的主要目的是为下一步造血分化

做准备,我们检测了代表全能性的几个重要指标——oc“、Nanog、SOX2以及

SSEAl,还有代表体内外分化潜能的检测叫B和畸胎瘤形成试验,发现都为阳
干细胞的基本要求。

性,从而基本上说明了这一细胞株具有自我更新以及多向分化的潜能,符合胚胎

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附图一
(下面数据为F-ES以厦棱移植来源的blT-ES细胞株一同进行全能性的鉴定)


A Oct4 Sox2 Nanog Klf4

攀≯; 0,j酴一}-‘r。
亭争

圈1显徽镜下F-lgS和/OF-E8的克隆型志




A和C为明蝎,B和D为荧光显徽镜下的型态.100X



亘||I|II!三一|I|二i _ Oapdh口置
c.Mw
圈2ES细胞的RT-i陀R和棱型检测
A为F-ES和NT-E8RT-PCR的结果;B为两者的核型检翱结果



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胚胎f■胞建系篪造^分化蠢匏的研究

图3体外髓形成试验
A、B分剐为rqT-ES和卜舀于体外分化至第8天形成的囊状明

图4SOX2、Nanq和SSEA!免疫荧光染色(来自F-ES)
TestIng中红色荧光舟别代表对应标志物的表达

Eckd黜

M签,odcrm

Endodenh

盈5崎舱癌检嗣结果(来自F-ES)

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旺胎十细胞建蓐&遗n分化潜能的研究





蓝,J
图6嵌合体小鼠

A:为F_酷细胞来源的嵌台体小鼠(黑白色成体小鼠);B:为卅瞄细胞来源的嶷台体小
鼠(黑白色成体小鼠).两者箭头所指的纯黑色小鼠为嵌台体小鼠所生的生殖系嵌台小鼠。

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第二章’人孤雌胚胎干细胞的培养鉴定

研究目的 通过对人孤雌胚胎干细胞(pliES cell)进行培养鉴定,掌握人胚胎干细胞培养技 能的同时,可以了解人孤雌胚胎干细胞的生物学特性。

材料 1、人孤雌胚胎干细胞株来源

来源于广州医学院第三附属医院妇研所 2、主要使用仪器
除第一章所提到的以外,还有ABDl00 GeneticAnalyzer。 3、主要试剂 试剂 生产公司 GⅢCO
HYCLONE
C11330 SH30071.03

货号

DME腑12
Fetal Bovine Serum

Pen/Strep(1 00X) L—glutamine(1 00X) NEAA(1 00X)
2-Mercaptoethonal

CHEMICON CHEMICON CHEMICON
CHEMICON
G【BCO

田讧S.AB.2C

TMS.002.C
们MS一001.C ES一007.E 17104.019

胶原酶Ⅳ

4、主要检测试剂 试剂
Ex Taq Hot

生产公司
Takara INVITROGEN PROMAGA INVITROGEN Santa Cruz Santa Cruz
30

货号
DRR006B

Start(PCR检测)

总RNA提取试剂盒

12183-018

cDNA反转录试剂盒
Goat ant i SSEA—-3
rat rat

IgG‘’PE

ant i mouse

SSEA—?4 rat ant i

mouse

培养皿

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Oct4 rat anti

mouse

Santa Cruz Santa Cruz Santa Cruz

Tra一1—60 rat anti Tra——1-81 rat anti

mouse

mouse

5、phES细胞培养液的配制 试剂
DMEM/F1 2
KSR FBS 190ml 42.5ml 7.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml lOOul

用量
76% 15% 5% lmM 0.1mM 0.1mM lX

终浓度

L—glutamine(100X) 2一ME(100X) NE从(100X) P/S(100n) bFGF(10ug/m1)

4ng/ml

方法 一、培养
1.传代 a.酶消化法:将35mm培养皿中的培养液去掉后,用PBS洗一次,然后加lml左

右的浓度为lmg/ml的胶原酶Ⅳ,培养箱内放置20-30分钟;显微镜下见克隆微微 收缩,成纤维细胞变成细长状时,即可以加培养液中和并用lml的加样枪吹散; 收集细胞到一根14ml的离心管中,1000转/分钟,离心5分钟;去上清后,根据 细胞密度进行接种,如果克隆生长良好的话,一般按1:3传代。接种后,需每天 换液,大概4-6天传代一次j b.机械法:机械法操作更为简单。将采血用的毛细管(国产)在酒精灯下拉成细 针,在解剖显微镜下找到需要挑取的克隆,用针的细端轻轻压在克隆上,压的同 时可以将针轻轻的前后移动以保证克隆被压成两半,通常一个克隆最少可以压成4 块:用200ul的加样枪轻轻地将克隆吸起来并转移到另一个铺上feeder的培养皿 中。可以根据接种的需要选择不同的培养皿,通常一个35nmn的培养皿可以接种

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

20-30块克隆碎片.每天换液,4-6天传代一次。目前,这株phES细胞传代已经 超过60代了。 2.细胞的冻存与鹪冻(请参见第一章) 二、鉴定 1.总RNA的提取(请参见第一章) 2.cDNA的合成(请参见第一章) 3.PCR检测Oct4
Gene Oct4 B-actin Forward pri
mer

Reverse primer

Size t

TM值

5’一姗CAGCCAAACC-ACCATCT-3’ 5’-ACACTCGGAC班CATCcI册3’

297,57℃

5’一从0GGflll黼amlTG一3’

5’--GG-AAGATGGrGATGGGATT-3’

2∞,53℃

4.EB培养 将1个60ram的培养皿用胶原酶消化下来,转到另一个新的培养皿内,培养箱 内放置30分钟,以去除部分饲养层;然后收集没有贴壁的细胞,1000rpm离心

5分钟,去上清;用无bFGF的phES细胞培养液将细胞悬浮起来,并转移到lOOm
的细菌培养皿中,添加13ml上述培养液,让phES细胞自发分化。 5.免疫组化检测SSEA-4、SSEA-3、TRA一卜60、TRA一卜81(步骤参见第一章) 6.染色体的检测(参见第一章) 7.STR位点的检测 收集1个60ram培养皿的ES细胞,提取DNA(步骤相见试剂说明书),然后使用
ABl3100 Genetic

Analyzer检测。

8.畸胎瘤的检测 收集1个60ram培养皿的ES细胞,将细胞悬液调整到0.2-0.3ml左右,注射到 SCID小鼠腹股沟皮下。观察畸胎瘤的生长情况,大概30-40天后可以处死小鼠 取出畸胎瘤,然后进行病理切片。

结果 1.PCR检测结果 PCR检测结果显示phES细胞能够强表达Oct4转录因子(见图1)。 2.EB的检测
32

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

图2中为分化至第20天的EB,说明这株phES细胞具有体外分化的能力. 3.免疫组化检测 标志物SSEA-4、SSEA-3、TRA一卜60、TRA一1—81的检测结果都为阳性,说明这 株phES细胞具有全能性的特征(见图3)。 4.染色体检测结果 染色体检铡的结果显示核型为45,XO(见图4)。 5.STR位点的检测 检测结果显示它与供者的STR位点相匹配(见图5)。 6.畸胎瘤的检测 目前畸胎瘤还没有长出来,但检测已经重复超过3次。可能由于核型异常导致 这株phES细胞株的体内分化能力比较弱。

讨论 2007年,Kim等[14]通过体细胞核移植获得了一株人的孤雌胚胎干细胞,并通过 SNP得到了证实。此外,Mai等[16]报道,在他们建立的两株phES细胞中,其中一 株为正常核型,能够表现正常的生物学特性;而另一株在长期传代过程中产生了 染色体易位现象,并且一直没有长出畸胎瘤,提示异常核型的phES细胞的分化能 力弱。 这株phES细胞能够表达Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1—60、TRA一1—81等标志 物,基本上具有hES细胞的基本特征。它能够形成髓,提示它具有体外分化的能 力。核型检测显示这株细胞为异常核型,提示可能由于核型异常导致畸胎瘤检测 阴性。总的来说,这株phES细胞基本具有自我更新以及体外分化的能力,但分化 能力可能比正常人胚胎于细胞弱。

胚胎干细胞建系且造m分化潜能的研究

附图二


Oct4


1i、i■—]

actin

圈1 P傩检测Oct4以及自发分化了加天曲髓 A=Oct4的检涌;1:ph皓,2:H9(阳性对熙),3:成纤维细胞(阴性对照) B:ph髓细胞自发分化到第20天的邛
DAPI

Testing

圈3免疫荧光染色
Testing中红色荧光部分为对应的标击物

匝j至E日趸里互日匮工五团

田4梗堑:45,XO

==!!U.——..蓦}———————^_,———毒———————女—。————————l
罨k——,}一
雩l
^.



.i



—T—鼍孽耳r—广—赢岛=岬P却。昔嗜i:?1——广———*墨}———rF———百而暑—r =;L世——上—————一杼———————一

.i;: .。二


二:



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司{D

一1——;;ir—rT■a∞g}1}9嚣o—广一——iiiibi

…』I

、l 1

.1

l^ I

置L二~—!I一上一一[



圈5 STR检舅结果

第一部分

小结

1、我们建立了2株129/0G2 Es细胞系,而且完全符合胚胎干细胞的特性,这为 下一步造血分化提供了原材料。 2、从上述几个重要全能性标志物检测来看,phES细胞都表达阳性,这与正常的 hES细胞没有明显区别。但从我们检测畸胎瘤的结果来看,这株phES细胞的体 内分化能力明显比正常的hES细胞弱。这种全能性的减弱可能是由于核型异常 所导致的。

第二部分胚胎干细胞的造血分化

第一章

核移植小鼠胚胎干细胞造血分化潜能的研究

克隆小鼠通常在外形上表现一些异常的特征,如肥胖、易老等,这可能是由于 核移植后细胞在进行重编程过程中出现错误的遗传重组所导致的[63,64]。几组实 验研究都发现,核移植能够影响某些印记基因如Igf2r、H19、Meg、Ascl2等的 表达[65-67]。此外,基因芯片检测同样表明核移植后存在着某些异常基因[68]。 为了阐明NT-ES细胞在体内外的造血分化潜能,我们进行了深入的探讨。 研究目的

对核移植胚胎干细胞(肌ES)进行造血分化,探讨它的造血分化潜能。
材料 1.胚胎干细胞株来源 受精来源的胚胎干细胞(简称为F.ES)来源于第一部分第一章建立129/0(32细 胞株,稳定传到第18代时进行分化,在实验中作为对照;核移植来源的胚胎干细 胞(简称为Nr-ES)是用129/OG2小鼠睾丸的滋养细胞作为供体,通过核移植所 得到的胚胎干细胞,同样取第18代细胞进行实验。由于0(32小鼠的基因Oct4后 融合了基因GFP,所以NT-ES和F.Es细胞在未分化阶段都能够发出绿色荧光。

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

2.主要仪器 仪器名称 CO:培养箱 C0。培养箱 流式细胞仪 流式细胞分析仪 荧光显微镜 普通倒置显微镜 -80℃冰箱 液氮罐
RealTime Thermo HERA DakoCytomat i on

生产公司

型号
HEPA class 100 Cell Moflo FACSCal i bur lX71 Ecl ipse TSl00 U570 LT509IX25 7500 PTC——i 00 RCM
150

BD公司
Olympus Nikon
NE田BRUNSWICK SCIENTIC

Barnstead International

PCR仪

ABI
BIO-RAD


普通PCR仪 旋转生物反应器
Cyt ospin

Synthecon

USA

国产
E1ectrolux OAKION

普通冰箱 水浴锅

3.主要试剂 3.1细胞培养试剂 试剂
Knockout DMEM GIBCO

生产公司
l0929

货号

DMEM

CHEMICAN
GIBCO HYCLONE

SLM.220.M
1028 SH30071.03

Knockout Serum Replacement
Fetal Bovine Serum

Pen/Strep(I OOX) L-glutamine(1 00X) NEAA(IOOX)
2-Mercaptoethonal

CHEMICoN
CHEMICON CHEMICON CHEMICON CHEMICON

TMS.AB一2C

TMS.002℃
TMS-001-C ES.007.E ESGll07

UF

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

3.2造血分化试剂 试剂
IMDM(1L X10)

生产公司
INVITROGEN 1 220.036
03134

货号

Methylcellulose(咩I基纤维素)
SCF IL.3 IL一6 EPO
VEGFR2

STEM CELL
R&D R&D R&D R&D
R&D

455.MC

403.ML

406.ML
959.ME
443.KD

3.3检测试剂 试剂 PE-CD34抗体 PE/Cy5一Sea-1抗体
FITC.CD45R/220

生产公司
Biolegend 119307

货号/型号

Biolegend

122509

Biolegend

103305

Flk.1抗体(1抗,rat anti Flk-1抗抗体(2抗,goat

mouse)

BD Pharmingen

550549

anti rat)

INVITRoGEN

AlexaFluor mouse IgG

546

goat

anti

SYBR Premix EX

Taq(相对定量)

Takara

DRR041A

Ex Taq Hot

Start(PCR检测)

Takara INVITRoGEN

DRR006B
12183-018

总RNA提取试剂盒 T载体 cDNA反转录试剂盒 DNA提取试剂盒

瑚(ara
PROMAGA TianGene(天根)

pMDl 8一T Simple

Vector

DP304_02

3.4其它

胚胎于细胞建系及造血分化潜能的研究

名称
Petri dish(3 5ram) Culture dish(35ram) Culture dish(60mm)

生产公司
FALCON FALCON FALCON GIBCO
351008

货号

353001 353002
25300

胰酶(O.05%)

4.培养液的配制
4.1

ES细胞培养液配制 成份 用量
8lml 15ml lml lml lml lml 10ul 100ml ≈80% 15%


终浓度

DMEM
FBS

Pen/Strep(100X) L-glutamine(100X) NEAA(100X) 2.ME UF
Total Volume

100U/ml(1均

2mM(1Ⅺ
O.1mM(1殉
O.1mM(1X)

1000洲

4.2IMDM的配制 成份 IMDM(粉装)
ddH20 NaHC03 Total Volume

用量 10∥l包
1L 3.0249 1L

4.3预分化培养液的配制 将ES培养液里的DMEM更换成IMDM,其它成份及比例不变。 初步分化培养基的配制

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

成份 Methylcellulose(2.6%)
FBS L-glutamine

用量
40ml 15ml 1ml 1.5ml
80Ill

终浓度
1%
15%

2mM O.15uM
40ng/ml

2.ME SCF(50ug/m1)

蚴M
Tbtal、,olume

42.5ml 100ml

4.5分化补充培养基(feed medium)的配制 成份 初步分化培养液
FBS 15ml

用量

终浓度

踟.5%
15%

2.25ml
45ul 96ul 90ul 120Ill 180ul

2.ME
SCF(50ng/u1)

15洲
1 60ng/ml 30ng/ml 20ng/ml 3U加[1l

IL?3(1 Ong/u1) IL一6(5ng/u1) hEPO(500U/m1)

蛐M
Total

12.22ml

30ml

4.6分化培养基的配制(用于造血集落形成试验)

成份
Methylcellulose(2.6%)
FBS 40ml。 15ml lml

用量
≈1%


终浓度

15%

L—glutamine

2mM O.15uM
1 50ng/ml

2.ME SCF(50ug/m1) BSA(5%)

1.5ml
0.3ml 20ml

l%

40

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

TransfenSn(O.1 g/m1) IL-3(1 0ng/u1) Ⅱ一6(5ng/u1) EPO(1 0ng/u1)

0.2ml 0.3ml 0.6ml 0.1m1 21ml
?

200ug/ml

30ng/ml
30ng/ml lOng/ml

帅M
Total Volume

lOOml

方法 1.分化流程图

p砌上撕锄
Primary Differentiation



Cro如rm勰5 wid坩毗斜协撕嘲)
Bl。.CFC

Trtm墨plantafioa

删q岫瞄臼p瑚阁留h哪叫ttic

¥ccondary

Hm'natopoi娟c Differentiation
at

diffQ

谨C吨-s町
Ei3



atrT)

粥mrandR鲥血酣p镰懈cFC删缈
(分化方案主要来源于http!//www.stemcell.corn)

2.ES细胞常规培养 进行分化实验前先将细胞传1-2代,使克隆生长处于良好状态(保持95%以上的
细胞没有分化,具体步骤参见第一部分第一章).

3.体外造血分化
3.1

ES细胞的预分化培养
41

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

预分化培养条件与Es细胞的常规培养方法一样,但需要将DMEM更换为IMDM(称 为预分化培养液),其他成份及浓度不变。将上述ES细胞以IXl04个种到35咖的培养 皿中,传2—3代,使克隆生长处于良好状态。由于IMDM比DMEM更有利于EB的形成, 所以预分化的目的是为下一步EB的培养做准备。
3.2

EB的培养

a.粗略评估ES细胞生长状态:克隆生长大概占整个培养皿面积的30-50%就可以, 以保证克隆生长处于良好状态;镜下克隆形态良好,只能见极少数或没有出现分 化的细胞(分化的细胞大大地降低EB的形成率),如果分化比较严重,可以通过传 代或重新解冻细胞培养后再进行下一步操作。 b.处理ES细胞: 用0.05%的胰酶将ES克隆处理约2分钟(比正常消化时间大概短

30s-lmin),镜下见克隆微微松开时即加2-3倍培养液中和;轻轻将培养液摇晃几 下,大部分克隆都可摇脱下来并以细胞团的形式存在,而大部分feeder细胞仍留

在培养皿中;收集上清,并转至一个新的60m培养皿中,培养箱内静止30分钟,
尽可能除去成纤维细胞;最后收集上清,500转/分钟,离,b5分钟,此时肉眼可见 细胞团都聚在管底,上清由于还有一些单细胞而显得有点浑浊,其中包括一些 feeder细胞;轻轻吸掉上清并力D2ml含10%FBS的IMDM培养液重悬,用孔径为70um 的细胞筛网过滤并计数。 c.接种:每个直径为35mm的petri dish中接种6000个细胞。接种时,细胞悬液: 初步分化培养液----0.2:2的比例配制,最后使甲基纤维素的浓度为0.9%。接种前 先计划好需要接种培养皿的个数,如需要接种7个,那么先调整细胞浓度,使1.4ml

的I百蝴养液里包含4.2万个细胞;然后用移液枪加入14ml的初步分化培养液,充
皿中内置一个装有3ml PBS的35咖无盖培养皿,使大培养皿内保持100%的湿度。

分混匀;最后用5ml的注射器针桶和20ml注射器磨*的针头连接后向每个petri dish中接种2.2ml。将接种好的petri dish置于直径为150mm的培养皿内,然后在

最后将培养皿置于3713,5%CO:的培养箱内培养。由于甲基纤维素比较粘稠,接种 时最好使用6cc的移液管和16号口径的钝头针头进行接种,这样可以防止加样过程 所造成的误差。 d.EB培养到第7天时,向每个培养皿中添加O.5ml的feed medium。由于甲基纤维 素比较粘稠,添加时注意分布均匀,以保证每个髓的发育都受到细胞因子的作用。 3.3爆发集落形成细胞(Blast-CFC)

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

为了进一步评价NT—Es细胞的造血潜能,我们将培养至第3.5天的EB用0.05%的胰酶 消化成单个细胞后(消化时间为1分钟左右),重新接种到含5 ng/mL VEGF、5ng/m1
IL-6、50 ng/mL

SCF的0.9%的甲基纤维素中,培养4—6天后观察结果。

同时,我们将形成的blast细胞团收集起来,处理成单个细胞,再次接种到O.9% 的甲基纤维素上,其中含有2 U/札Erythropoietin、25 ng/mL IL一11、10ng/m1
IL-3、30 ng/mL

C-CSF和5 ng/mLIL-6。培养一个星期左右观察红系集落的形成

情况并进行计数,培养12天后进行其他细胞系集落的计数。
3.4 Cytospin

对单个集落进行涂片,并用瑞士一吉姆撒染液进行染色,操作步骤如下: a.根据集落形态,用口吸管吸出每个细胞集落,转到预先加有lOOul PBS的EP管 中,用PBS离心洗涤3次,最后向管中加50ulPBS重悬细胞。 b.Cytospin:200-500rpm,离,b2分钟,细胞被甩到玻片上特定的地方。 C.干燥后,用甲醇(原液)固定10分钟。 d.干燥后,用瑞士染液:吉姆撒染液=8:2的比例混匀后,加到涂片上有细胞的地 方;染色10分钟,冲水,干燥后油镜观察。
4.Realtime PCR

4.1总RNA的提取和cDNA的合成(参见第一部分第一章)
4.2 Realtime PCR:

a.按照Takara公司的SYBR

Premix Ex

Taq试剂盒说明书进行操作,PCR反应液

各组份配制如下(反应液配制在冰上进行): 试剂
SYBR Premix Ex Taq

用量
lOul 0.4ul 0.4ul 0.4ul 2.Oul 6.8ul 20。Oul lX

终浓度

PCR Forward Primer(10uM) PCR Reverse Primer(10uM) ROX Reference Dye 11

0.2uM 0.2uM
lX <lOOng

DNA模板 dH20(灭菌蒸馏水)
Total Volume

反应液配制过程中最好避光操作,因为荧光燃料ROX

Reference Dye

II对光敏

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

感。试剂加到反应管以后,用甩板机将管壁上的液体甩下来,然后上机操作。

b.反应条件:由于使用的仪器是ABl7500,选用的条件是:95℃,10s一 95℃,5s_60"C,34s,反应40个循环。
c.检测基因的引物序列:
Genes CD34

Primer sequences 5’一Kn℃GCCTA舶rA A1隗oCAGC.3’
5’.AGACA(玎.AGCACCAGCATCA.3’

Tm,℃
54

Size,bp
255

CDll7

5’一GCTCp(rTGGCI]n℃TGGT-3’
5’.GAAGTTGCGTCGGGTCTA.3’

53

155

Bmp4

5’.TGAGCClYITCCAGCAAGllT.3’ 5’—CT_rCCCGGTCTCAGGl涵=rCA.3’

59

180

nk.1

5’CATTCmACAAGCAIACGG.3’
Hoxb4

5’.(祀AGGA A ACl’ACACGGTCAr-3’
5’-1除CC,I=ACCCAGCGACCAC■3’ 5’.GACGACGGGcTCTrrGC.3’

54

266

55

339

Smad5

5’耵CCCGATTCT丌CCACC.3’
5’.(Ⅺ£TCCTC』吼~GGCGACA.3’
5’.AGGGCAATGAGCAGAGrITC.3’

55

286

H.2k

56

184

5'-TCTTCGT陀AGGGCG茂r(、1’A.3’
GAPDH 5’.TGCCCAGAACATCA:rCCCT.3’ 55 232

5’.GTCCTCAGTGTAGCCC从(}3’
+Gatal 5’.AGGAATGCCAGCGGAGAT.3’ 5’.AGTGCCCAGTGCCAAGC.3’ ’Runxl 5’.GGAGCGGTAGAGGCAAGAGC.3’ 60 225 56 261

5’CGGGTGAAATGGGTGTCG.3’
‘SCL

5’-TATGAGATGGAGAmCTGATG.3’
5’.GCTCCTCTGTGTA ACTGl℃C.3’

55

369

‘Gata2

5.CTCCAGCI]陀ACCCCTAAGCA(}3
5.CATAAGGTGGTGGTrGTCGTCT-3

60

254

+专-Globin

5.GCTCAGGCCGAGCCCATrl3‘孓3
5-TAGCGGTACTTCTCAGTCA(k3

55

371

’BHl.globin

5-CTCAAGGAGACCrITGCTCA.3

55

265

5-AGTCCCCA,rGGAGTCAAAGA.3

宰用于RT—PcR检测

d.数据分析:数据采ABI公司的SDS v1.2x软件进行分析。 5.RT-PCR检测 使用的试剂为Takara公司的Ex
Taq Hot

Start试剂盒。进行PCR时的反应体系为:

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

成份
lOXbuffer dNTP Forward pr imer Reverse primer Taq Ex Template dH20 Total Vol ume 2ul 1.6ul 0.3ui 0.3ul 0.1ul lul

用量

14.7ul 20ul

反应条件:95℃2min叫5℃30s一万∞30s—啼72℃imin_
72。C

lOmin,在反应步骤2和4之间反应35个循环。

6.流式细胞仪分析
分别收集第5天、7天、10天的髓,用离心机离心洗涤3次;然后用浓度为lmg/ml

的胶原酶Ⅳ消化30-40分钟;接着用孔径为70um的细胞筛过筛,离心后去上清, 用1%BSA(用PBS溶解)重悬细胞,将细胞密度调整至lXl08个/300ul左右;分别 加入PE-CD34抗体、PE/Cy5-Sca-1抗体,4"C下孵育30分钟后用流式细胞仪分析,
同时使用PE和PE/Cy5标记的同型抗体标记细胞作为阴性对照。数据采用
DakoCytomation summit

v4.0软件进行分析。

7.免疫荧光染色
a.取第8、第10天的EB,用4%PFA(多聚甲醛)室温固定24,时,也可以4℃过夜; b.用PBS连续洗3次,每次15分钟,室温操作即可; c.封闭:用5%的BSA在petri dish上做3个液滴,将洗好的EB在液滴里洗1-2次,

然后置于最后一个液滴内,培养箱内孵育30分钟; d.用1%BSA将Flk—l抗体(rat
anti

mouse)1:500稀释后,在petri dish上做

液滴,将EB置于液滴内,培养箱内孵育2个小时,或4"C过夜; e.用PBS连续洗3次,每次15分钟,室温操作即可;
f.用l%BSA将二抗(goat
anti

rat,发射波长为546nm)1:300稀释后,在petri

dish上做液滴,将EB置于液滴内,培养箱内孵育2个小时,或4"C过夜; g.用PBS连续洗2次,每次15分钟,室温操作即可;
h.加入DAPI(1:10)稀释,,室温孵育10分钟;
4S

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

i.用-PBS清洗1次,室温15分钟: j.封片,荧光显微镜观察。 8.成体小鼠*系统成份分析 我们分别收集克隆小鼠(NT-mice)以及受精来源的小鼠(F-mice)的骨髓细胞进行 流式分析,收集外周血进行血常规检测。此外。我们还将背景相类似的129/sv、 OG2/J、鼠外周血进行血常规检测,与前两者进行比较. 9.造血移植 a.细胞培养:将NT-ES和F-ES细胞消化处理后,分别置于lOOmm的petri
dish

中培养,每个皿中接种细胞数量调整为IXl06个,所用的培养液为含15%FBS 的IMDM培养液,用量为13ml/培养皿。每株细胞分别做3—4个直径为lOOm 的培养皿。 b.分选细胞: 将分化到第3.5天的日用50ral的离心管收集起来,然后用PBS

离心清洗以后,加5-10mi的胰酶消化1-2分钟,加2倍体积的上述培养液中 和,1000rpm离心5分钟:去上清后,再加3-5mi的上述培养液,70um细胞筛 过筛并计数;加入PE_Flk_1抗体,4℃孵育30分钟,最后用流式细胞仪分选 Flk-1+细胞,并收集到加有0.5mlIMI)M的EP管中。 c.c57BL/6小鼠的亚致死量照射:细胞分选前一天,先将6-8周的受体小鼠c57BL/6 用钴60亚致死量照射,剂量为8Gy(致死量常为9.5Gy)。照射后24小时内进 行造血细胞骨髓腔移植。 d.小鼠照射前后的护理:将PH调整为3.0-4.0的dH20进行高温高压灭菌,在小 鼠半致死量照射前1-2天给喂上,并一直保持到移植后半个月,目的是促进胃 肠道的消化和吸收功能;移植后将小鼠置于软纸上,最好有热光源照射;移植 后半个月内每天都要去观察小鼠的状态;每3天喂上无菌鸡蛋黄、葵瓜子等补 充营养。 e.移植造血细胞:先用麻醉药(ALDRICH公司的,货号为:24048-6)进行麻醉, 用量为0.3ml;当小鼠不能走动时,用酒精棉球擦拭小鼠右侧小腿膝盖处,先 用iml注射器在胫骨的侧面向脚方向慢慢旋转刺入,此时动作要慢,防止动作 过大而刺破手指头;当针头真正刺入骨髓腔时,轻轻旋转注射器能带动的腿另 一端转动,而且再往前*胪肥弊枇Υ螅蝗粽胪反探∪饣蚪岬拮橹铮 者进入骨髓腔后又穿出来时,上述情况都不太明显;拔出针头,用50ul的微

胚胎千细胞建系及造血分化潜能的研究

量注射器吸30-40ul的细胞悬液(分选后将细胞浓度调整为lXl06/30-40u1) 沿着之前lml注射器进针的地方进去,将所有的细胞悬液都*焦撬枨焕铮 移植完毕后,在鼠笼里的一头放置一张无菌的软纸,并小心将小鼠放在上面, 最好有加热光源照射。 f.检测:处死小鼠后,分别收集骨髓、脾以及外周血,加促红细胞裂解液,室温 放置10分钟;1000转/分钟,离心5分钟,去上清后进行基因组的提取,提取 步骤参照试剂盒(天根公司)进行,并用Takara公司的Hot 进行基因组GFP的检测。 由于实验室存在严重的GFP污染,我们通过设计引物Oct4-GFP来进行检测, 可以很好地解决这一污染问题。引物上游位于Oct4,下游位于GFP,序列分别是:
Forward:5’一GACAGGcACTcTGAGGGcTATTc一3’: Reverse:5’一CTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAG一3’ Star

PCR试剂盒

扩增片段大小为792 bp,Tm值为60℃。由于Oct4-GFP在基因组里为一对融合基因, GFP和Oct4共用Oct4的启动子,所以当细胞处于未分化阶段时,能够表达绿色荧 光。当细胞发生分化以后,绿色荧光会减弱或消失。在造血移植过程中,我们可 以通过检测基因组里GFP的存在与否来间接反映相应细胞的存在与否。为了保证 引物设计正确,我们将PCR产物与T载体连接了以后进行测序.测序的结果跟我 们设计引物时所用的序列是一致的。 9.统计学分析实验数据均用_+SD表示,两组数据间的比较采用t检验。 结果 一、N,r—Es和F_ES细胞全能性的表达情况 从形态上看,两者克隆没有明显的区别,此外,我们还检测了它们几个重要的 全能性标志物:Oct4、SSFA-1、Nanog、SOX2等的表达情况,结果都为阳性;畸胎 瘤检测都能形成3个胚层。从全能性来看,两者没有明显的差异(参见第一部分)。 二、NT—Es和F-ES在EB形成和发育上没有明显区别 1.在EB发育过程中,NT-ES和F-ES在几个不同阶段形成的EB型态都没有显著差 别 我们分别比较了第5天、第7天、和第10天的EB型态,发现两者差别不显著。 第3天到第5天形成的EB属于早期EB,观察两者的型态,从朗边缘的整齐性、 致密度、大小以及色泽来看,都差别不大。第7天的EB相当于一个过渡期,从早

胚胎千细电毫系厘造■分化潜能的研究

期过渡到成熟的造血髓t可见两者匝的致密度比早期髓稍有松散,而且周围也 开始有一些髓系的细胞向外扩散,两者差别也不显著。第10天以后,会形成一些 造血髓,其致密度比前两者更为松散~些,周围出现较多的筒系细胞,多为粒单 系细胞;中间常出现泛红的现象,主要为红系形成的血红蛋白。从上述3个阶段 来看。两者在髓型态上区别不大(见图1)。 2.两者在髓形成的数量上投有显著差别 我们统计了第5天的总印和第12天的遣血EB,发现两者在总船和造血髓形 成的数量上都没有明显差别(见图2)。NT-ES和F_酷形成总髓的数量分别是129 和134,造血部形成的数量分别是73和78。从表1可以看出两者在总髓和造血 即形成的数量上都没有显著差别(P>O.惦),而且由他们所得出的造血髓形成率
(Hemtopoietic

EB/Total髓)也非常接*,分别为56.5%和58%。此外,藐们

在EB培养的第8天分别统计了两者囊状髓的形成数日,分别为12和10个/8000 个ES细胞,差别也不显著。囊状盼的形成通常被认为是中胚层发育良好的表现。 而中胚层直接分化为造血细胞(见表1)。

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表l总EB、囊状EB以及造血功的形成情况
^:总日l及遗血ER的形成教量;B;囊状即的形成比倒;C:造血EB的形成率


胚胎千细胞建系及造血分化潜能的研究

3.免疫荧光染色显示两者髓的发育趋势相接* 从图3可以看出,EB发育到第8天时,细胞本身所带有的GFP在NT—Es和F_Es 细胞中还有部分表达,Flk-I也强表达;到第10天时,两者都不表达GFP,但Flk-1

仍然是强表达。这说明,代表全能性的标志物珈ct4到第10天时表达水*已经明
显下降,而代表中胚层的重要标志物Flk-i仍然表达,这对NT-ES和F-ES细胞来 说,它们的变化趋势都基本一致。 三、两者的BL-CFC形成能力以及造血集落的形成数量大致相同 BL-CFC形成试验是一个最早能够体现是否具有造血和血管形成潜能的试验. 通常我们是利用第3.5天的EB进行,因为这时Flk-i的表达水*最高,而Flk-I 又是一个代表早期具有造血潜能的重要的中胚层转录因子。通常,在培养的同一 个皿中,我们可以看到3种不同型态的细胞团:次级EB(Secondery髓)、过渡型 集落(Transitional FB)、爆发型集落(Blast EB)。次级髓为一些全能性比较强 的ES细胞再次形成的EB;过渡型集落的体积比次级髓要大,整个结构比次级髓 要松散一些,中间也经常出现一些泛红的色泽,为红系形成的血红蛋白,但造血 潜能不强;爆发型集落的结构相当松散,周围可见有较多的髓系细胞向外扩散, 而且中间红色的色泽更加明显,大小与过渡型集落相当,通常这些集落被认为具 有高度造血潜能的集落(见图4)。我们比较NT-ES和F-ES在爆发型集落形成的数 日,发现两者相差不大,进一步说明两者的造血潜能相当。 另外,我们收集这些细胞团进行造血祖细胞的造血集落形成试验,发现两者在 红系、粒单系以及混合系中的形成数目相当,没有显著差异。 此外,我们取出NT-ES形成的红系集落进行cytospin,然后进行瑞士.吉姆撤 染色,染色结果显示主要为早期的原始红细胞(见图5)。 四、流式细胞仪分析 我们利用小鼠造血干细胞表面两个重要标志物--CD34和Sca-1进行了检测,发 现NT-ES和F-ES细胞在分化过程中的表达水*相接*。在分化过程中,我们分别 检测了第5天、第7天、第10天的EB细胞,NT-ES细胞分化成CD34和Sca-1双 阳性细胞的比例分别为:6.58%、32.03%、23.44%;F-Es细胞的分化比例分别为: 10.35Y、22.88%、16.54%。虽然NT—ES细胞在分化早期(第5天)双阳性细胞的 比例比F-ES的稍低~些,但随着NT—ES细胞分化发育的成熟,两者的比例越来越 接*,差异不太显著(见图6)。

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

五、Realtime

PCR

我们对基因CD34、CDl 17、H2-k、Bmp4、Flk-1、Hoxb4、Smad5进行了相对 定量检测,发现两者变化趋**。造血细胞的几个重要基因:CD34和H2-k在 分化的第10天前都是以较低水*表达,到第10天后才稍有提高,到第16天检测 时水*最高;Hoxb4的过表达能够促进造血分化,它在培养的第10天前表达水* 稍稍略低,第lO天和第16天的表达水*相当;代表中胚层的两个重要基因:‘Flk-1 和Bmp4分别在检测的第6天达到表达水*的高峰,随后都分别降到一定的水*; CDll7的变化水*跟前两者相当;Smad5是一个有趣的基因,它能够抑制造血分 化。可以看出它在两者的ES阶段表达水*都比较高,但随着分化的进行,Smad5 的表达水*都分别降低到一定水*,说明诱导的途径有利于造血分化的进行(见
图7)。

六。成体小鼠*系统成份分析 为了进一步说明两者是否有差异,我们分析了成体小鼠的骨髓细胞和外周血的 成份。我们利用造血标志物cD45R/B220、CD34以及Sca-1分别对克隆小鼠(NT-mice) 以及受精来源的小鼠(F-mice)骨髓细胞进行流式分析。发现它们在上述3个标志 物的表达水*上都非常接*:在NT-mice和F-mice中CD34和Sca-1双阳性的细 胞比例分别为33.29%和37.17%;CD45R/B220阳性的细胞分别为40.30%和40.34%。 CD46R/B220阳性细胞主要为一些淋巴细胞,代表着一定的免疫功能。可以看出. 两者在这3个标志物阳性的细胞上差别。 此外,我们还分别检测了NT-mice、0G2-mice、F-mice、129/sv小鼠的外周血, 分别比较了她们的白细胞、红细胞以及血小板的数量,发现这四者的比例相当, 没有显著差异(见图8)。 七、造血移植 对C57BL/6小鼠进行致死量照射移植后,小鼠容易死亡。所以我们选择亚致死 量(8Gy)进行照射。我们用处理后的NT-ES和F-ES细胞分别移植到7只小鼠的 体内,移植后没有出现小鼠死亡的现象(见表2)。8周以后,我们分别取出注射 细胞的骨髓段、未注射细胞的骨髓段、脾、外周血提取DNA进行检测。检测的结 果是,两者都能在上述组织中出现移植细胞。为了进一步说明移植细胞是否在体 内发生造血,我们分别将骨髓和脾细胞进行造血集落培养,然后分别取出红系 (CFU—E)和粒系巨噬系集落(CFU—G够,提取DNA后进行检测,检测的结果也都为

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

阳性(见图10)。这可以肯定的说明,NT-ES和F—ES细胞在体内都发生了造血。

细胞种类:;l:移植乐鼠数量≥≤誊1:一番活时间:蔓蔓:乏交后存活总数。; !‘奎限E§j::j一一箩;÷黄%孝譬::∥譬和。乡矗“多8周y?::≯?爹一彳:萸7謦:管镌 …一?,“~。;::“‘“t‘a。
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表2造血移植情况 结论 NT-ES细胞在体内外都能发生造血,而且与F-ES细胞几乎具有一样的造血分化 潜能。 讨论 l、影响EB形成发育的因素 EB在形成过程中受到多种因素的影响,包括ES细胞的种类、培养方法(包括 半固体培养法、悬滴法、悬液法以及旋转培养等)、培养液的组成成份(血清的优 劣尤为重要)以及培养步骤等。如果培养方法以及培养条件都一样的情况下,当 然,影响EB形成数量的只有接种细胞造血分化的潜能了。通过与F.ES细胞进行 比较,发现两者在EB形成能力上没有显著差别,说明两者具有几乎一样的造血分 化潜能。 EB培养过程中,有几点值得注意的: 乱进行EB接种前,如果发现ES分化比较严重,需重新传代后或重新解冻一管细 胞,让克隆极少出现或不出现分化细胞才能进行接种,因为分化的细胞远远降低 EB形成的效率。培养ES细胞时,最好让克隆的覆盖率为30.50%,这样克隆的生 长状态会比较好。 b.接种前最好先对血清进行筛查实验。可以用一些造血分化潜能已经确定的细胞 株进行试验,这样可以保证待检测EB的形成效率。 c.保证培养皿内的湿度>95%。如果湿度下降的话,培养皿内的甲基纤维素容易变 干,这对EB发育影响大。 2、造血集落形成试验 造血集落形成试验是反映细胞是否具有造血分化潜能的一个重要体外试验。我 们在实验过程中有时会出现造血集落形态不够典型的现象,就是该出现爆发集落 的集落细胞没有很好地散开,导致集落形态不易辨别。通过适当提高常规细胞因
5l

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

子的浓度,形态才有所改善。从造血集落形成的数量来看,两者没有明显的区别, 而且涂片的细胞形态也没有差别,这说明它们在体外具有相似的造血分化潜能。
3、Real.time PCR

通常EB培养到第10天以后,EB中间容易出现变黑的现象,可能是由于营养不 足而导致EB内部部分细胞发生调亡现象。在这种情况下,如果收集同样一个35mm 的培养皿进行总RNA提取,浓度往往要比早期EB提取的浓度低得多。为了保证 实验顺利进行,应该提前(在第10天左右)适当补充一些营养成份或挑选一些状 态比较好的培养皿进行RNA提取。在相对定量检测过程中,我们分别检测了6个 基因,两者从未分化阶段一直到分化到第16天,变化趋势基本一致。虽然在某些 时候出现两者差异比较大,但由于流式细胞仪分析以及造血集落形成试验没有检 测出两者的差异,说明这种差异是可以忽略的。 4、流式细胞仪分析 目前检测小鼠造血干细胞常用的标志物有CD45、CD41、CD34、Sea.1、Fllc.1、 c.K“等,我们选取了其中一对常用的标志物—CD34和Sea.1进行检测。检测过 程中我们发现,有时候检测出来的双阳性细胞比例很高,可以达到70%以上。后 来发现,EB处理过程中容易产生较多的细胞碎片,可能会干扰检测的结果。所以 处理EB时最好能缩短消化的时间,同时最好尽量减少饲养层细胞的含量,防止对 实验结果造成影响。 5、造血移植 造血移植是我们这一实验过程中最为充实的一项实验。目前国际上能够查阅到 的有关胚胎干细胞造血分化移植成功的文章非常少。原因可能是从胚胎干细胞分 化而来的造血细胞在体内的归巢能力远比骨髓里正常造血干细胞差,又或者说分 化而来的造血干细胞本身在造血功能上就存在一定的缺陷。我们做了多批造血移 植,发现C57BL/6小鼠的移植效果要比其他品系小鼠的效果要好.这可能是跟 C57BL/6小鼠的活性强有密切关系。 为了进一步说明移植的细胞在体内发生了造血,我们将没有注射移植细胞小腿 的骨髓分成两半,一半拿来提取DNA进行上述的检测,同时将另一半接种到甲基 纤维素造血分化培养基上进行造血集落形成试验。一个星期后,我们吸取lO个造 血集落提取DNA进行检测,结果都为阳性(NT-ES的条带比较弱,可能是由于吸 取的细胞数量有限导致的DNA浓度偏低,通过增加提取的细胞数目以及优化PCR

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

反应体系,应该能够达到理想效果。),说明移植到小鼠体内的造血细胞的确发生 了造血。 此外,我们分别将两只scid小鼠形成的肿块进行病理切片,发现它们同样能够 长出内中外3个胚层。从各胚层的发育程度来看,显然比正常Es细胞来源的畸胎 瘤幼稚。出现这种情况的原因可能是分化了10天的ES细胞还残留着少量的胚胎 源性,可能由于这种情况导致了幼稚畸胎瘤的形成。Choi等[75]研究发现,尽管 分化了6周的胚胎干细胞,仍然能够检测出Oct4的表达,但可以看出Oct4表达的 量在不断降低。很显然,要进行造血移植,防止致瘤性的发生,必须先优化分化 培养系统,防止致瘤性的出现。目前,要进行造血移植需要要解决的问题是:l、 分化效率。2、致瘤性。3、分化细胞的造血功能。4、移植排斥反应。只有把这几 个问题都彻底解决了,移植才能达到理想效果。

胚胎十细胞建幕&造m分化潜能的研究

附图三

Day5

Day7

DaylO

NT.ES

弘7饕二
图l

F.ES

tqY-ES和P-ES不同发育阶段的匝形态

200X标尺=200um



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图2囊状即(^)和造血髓∞

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DAPI GFP

F1k.1

NT-ES

F.ES

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Nr-Es

F.ES

圈3船发育至第8天和第10天的免疫荧光荣色
A和B分别为印发育至第8夭和第lO的染色结果

Secondaw EB

Transitional colony

Blast colony



”旷 c渤筛
圈4 BL-CFC及适血集藩形成敦量

胚胎干细胞建蓑&造血分化潜能的研究

A-分别为欢甥EB,过渡里集落“厦爆发型集鞯
B:Blast colony的形成数量

C;来潭于第6夭EB的造血集落形成靠量





圈5红系造血集落以及瑞士.吉姆撒染色
^:红系造血集落100X;B:瑞士一吉姆撤染色显示相应的幼稚红细胞1000X

EB-dayl0

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图6流式分析结果

NT—ES

F—ES

压斛细胞建幕厘遗●分化着睫的研究






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胚胎千细胞建系最造血分化潜姥的研究

图8成律小鼠骨■及外周血细胞成份分析

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圈9小鼠移植过程及移植4周后形成的肿块
A:小鼠廨醉后从胫骨进行穿刺;B、c.D为穆植4周后形成的肿块

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NT—ES
F—ES



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胚胎于细胞建系及造血分化潜能的研究

图10移植8周后基因组PCR检测结果
A:Ⅳr—酷和F-ES注射细胞骨髓腔骨髓、未注射细胞骨髓腔骨髓、外周血、脾脏的检测结果 B:为骨髓细胞形成集落后,分别挑取多个红系和粒单系榘落检测结果 C:为脾细胞形成集落后,分别挑取多个红系和粒单系集落检测结果

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

第二章

初步探讨Bmp4对人类胚胎干细胞造血分化的影响

国内外关于人类胚胎干细胞造血分化的研究已经接*10年了,而对促进造血 分化效率的细胞因子研究最多的无疑是Bmp4,但从接种方法上却没有很大的改善。 我们通过改良接种方法,以及利用Bmp4进行造血分化,初步探讨人类胚胎干细胞 造血分化的作用,为人类造血移植打下坚实的基础。 研究目的 初步探讨Bmp4在人类胚胎干细胞造血分化过程中的作用,为造血移植提供参 考信息。 材料 1.人胚胎干细胞株来源 由广州医学院第三附属医院妇研所提供的人胚胎干细胞株hESl,为自行建系并 经过鉴定的细胞株。 2.主要仪器(参见第一部分第一章) 3.主要试剂
3.1

hES培养试剂


试剂

生产公司
GIBCo HYCI.ONE
C11330

货号

DMEM/F12
Fetal Bovine Serum

SH30071.03

Pen/Strep(1 OOX)

CHEMICON CHEMICoN CHEMICoN CHEMICON
GIBCo
Costar

TMS.AB.2C TMS-002.C TMS一001.C
ES-007-E
17104.019

L-glutamine(100X)
NEAA(IOOX) 2-Mcrcaptoethonal

胶原酶Ⅳ 超低吸附培养皿(6孔板)

347l

3.2造血分化试剂 试剂
IMDM(IL XlO)

生产公司

货号
1 220.036

矾VITRoGEN

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

hSCF

R&D R&D R&D R&D R&D R&D R&D
R&D

255.SC-0l O 203.IL.010 206-IL.010/CF 286.EP.250 314.BP 308.FK
357.KD 288.TP 56170l HSC003

tIIL.3 ML.6 llEPO Bmp4 Fh3 VEGF R2 TPo G.SCF

Biolegend

造血集落完全培养基

STEM CELL

3.3主要检测试剂 试剂
PE anti-human CDI 17

生产公司
Biolegend Biolegend Biolegend 323407 303507 316405

货号

PE/Cy5 anti——human
FITC CD34

CD38

4。试剂配制
4.1

hES培养液的配制 试剂 用量
190ml 42.5ml 7.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 100ul 76% 15% 5%

终浓度

DMEM/F12
KSR
FBS

L-glutamine(mox) 2-ME(1 00X) NEAA(]oox)

lmM
0.1mM

0.1mM
lX 4ng/ml

P/S(1 00X)
bFGF(10um/m1)

4.2分化基础培养基
6I

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

试剂
IMDM
FBS

用量 190ml
50ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 250ml

终浓度
76%
20%

I.glutamine(1 OOX) 2-ME(100X)

lmM 0.1mM 0.1mM
1X

NEA钺l oox) P/S(IOOX)
Total volume

4.3造血分化培养基的配制 试剂 分化基础培养基
SCF(10ug/m1) Flt3(Sug/m1) IL?3(1 Oug/m1) IL-6(1 Oug/m1)
.:

用量
29.52ml 90ul 30ul 30ul 30ul 150ul 150ul 30ml

终浓度

30neCml
5ng/ul

lOng/“
lOng/ml
50ng/ml 50ng/ml

O-CSF(10ug/m1)
宰Bmp4(10ug/m1)
Total volume

*Bml34组的分化添加Bmp4,cytokine组的不添加Bmp4;Control组的只用分化基础培养基

4.4造血集落完全培养基成份 试剂名称 甲基纤维素
FBS BSA L-glutamine 1.3% 25%

终浓度

2% 2mM 5X106M 50ng/ml

2.ME
hSCF

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

hGM.CSF
llIL-3 hEpo

lOng/ml

10ng/ml
3U/ml

?细胞悬液(含5(F%FBS的IMDM).上述完全培养基--0.2:2接种到S5mm的pctri dish中。

方法 i.hES细胞的培养 hES细胞的传代方法(具体步骤参见第一部分第二章) 机械法与酶消化法相比较,其优点是:1、传代时间快。2、可以减少旧培养皿 中的feeder传到新培养皿上。3、可以更好地控制克隆传代的密度。4、可以更好 地去除一些分化的细胞。其缺点是当旧培养皿中克隆比较多时,操作会比较繁琐, 传代地时间也比较长,所以这种方法不太适合培养皿比较大,克隆比较多的情况。 2.造血分化 2.i接种 将实验分成3组:control组(只添加分化基础培养基)、cytokine组(添加常 规细胞因子)、Bmp4组(常规细胞因子+Bmp4)。 A.机械法:用机械法将培养皿中状态比较好的克隆挑取下来,操作跟上述克隆传 代一样,不过可以将克隆稍微切碎一些,因为小碎片就可以很好地达到形成EB的 效果:将切成块状的小碎片接种到超低吸附培养皿中(为6孔板),每孔大概接种 15—20块克隆碎片(可以根据细胞生长的速度及密度适当调整接种的密度)。 B.酶消化法:我们利用酶消化法与机械法作比较看两者对EB形成的效果是否有 差异。用胶原酶消化处理克隆后(操作如前面所述),离心并去上清;用3-5mi的 分化基础培养液重悬细胞,并用70um的细胞筛过筛,计数板计数。向实验组的每 孔中接种细胞密度为IXl05个。 每组实验*衡做3个孔,每孔添加分化基础培养基2.5mi。24-48小时后,向每 组中更换相应的分化培养基2.5ml,每3天更换一次培养液。换液时将培养板放侧, 尽量吸去培养液。 3.检测 3.1流式细胞仪分析 分别收集各组第12天的髓,用PBS离心洗涤3次;然后用浓度为Img/ml的胶原酶
63

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

Ⅳ消化30一40分钟;接着用孔径为70um的细胞筛过筛,离心后去上清,用300ul %BSA(用PBS溶解)重悬细胞,然后分别加入PE-anti-human
CDll7、



PE/Cy5一anti-human CD38和FITC-CD34 3种抗体,4℃下孵育30分钟后用流式细胞

仪分析。 3.2造血集落形成试验 分别收集分化至第15天的EB,用浓度为Img/ml的胶原酶Ⅳ消化30-40分钟; 接着用孔径为70um的细胞筛过筛,离心后去上清。造血集落完全培养基里有两瓶 培养基,一瓶为细胞悬液,另一瓶为添加有各种细胞因子和l%甲基纤维素的培养 基。按照细胞悬液;甲基纤维素----0.2-2的比例接种髓细胞。我们将0.2ml的细 胞悬液与2ml的甲基纤维素充分混匀后.接种到35mm的Petri dish中,并置于 一个150m的大培养皿中,内置一个无盖的装有PBS或无菌蒸馏水的普通培养皿, 盖上大培养皿的盖子,置于培养箱内培养15天左右观察集落形态并计数。 结果 1.hESl克隆形态 显微镜下hESI克隆比较扁*,边缘圆滑,克隆中间细胞比较致密(见图1).

2.口的形态:在培养第5、10天,我们将3个组形成的EB形态进行了对比,发
现cytokine组(添加细胞因子)和Bmp4组(细胞因子+Bmp4)没有明显差异,形 成的腔体都比较大而且透亮,发育明显比control组要好(见图3)。 同时,我们对比了机械法和酶消化法处理后的结果:机械法处理后的细胞团第 二天就能形成很好的细胞团:第5天时,总朗数量相对减少,原因是发育过程中 部分髓融合在一起,但并不妨碍EB的发育。利用酶消化法处理后的细胞,发育 到第6天仍然星散沙状生长(实验重复了2次),形成EB的能力比较差。这可能 与hES细胞在呈单细胞或细胞团比较小的情况下不利于EB形成有关(见图2)。 3.流式细胞仪分析结果 用流式细胞仪分析了第12天的分化结果,发现Bmp4组要比另两组形成的造血 干细胞比例要高(见表1、2),大概为Cytokine组的两倍(实验重复2次),提示 Bmp4有利于促进造血干细胞的增殖。

胚胎千细麓建系及遗血分化潜醣的研究

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表l流式细胞仪分析结果

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

表堑\\
CD34+CD38一 CD34+CD38+ CD34+CDl 17+



Control 1.63% 1.48% 3.09%

Cytoki ne 4.77% 2.13% 4.40%

amp4

9.83%
2.80%

9.91%

表2 FACS中各种表型细胞所占的比例

4.造血集落形成试验结果 在造血集落形成试验中,control、Cytokines和Bmp4组形成集落的数目分别为
8、26和35,Bmp4组形成的造血集落数明显比Cytokinc组和Control组要多

(P<0.05),这也说明了Bmp4在体外能够促进造血干细胞的增殖。图3、4为形成 的混合型造血集落及其细胞形态。

表3造血集落形成数量 木陆p4组与Control组和Cytokine组在集落形成上分别都有明显差异(P<0.05)

结论 l、在人类胚胎干细胞造血分化过程中,Bmp4能够显著促进造血分化。 2、在EB形成和培养过程中,机械法比酶消化法形成EB的效果要好,而且减少 了外源细胞的污染;易于控制EB形成的数量以及接种的细胞密度。

胚胎千细胞建系及造J缸分化潜能的研究

讨论 1、机械法能够明显促进hES细胞形成形态良好的EB 目前,用于消化hES细胞

进行造血分化的常用方法是使用胶原酶行消化处理。但由于消化处理后往往给下
一步操作带来较多的feeder,而且消化过程对部分hES细胞有伤害作用,所以我们

使用机械法来代替酶消化法。在EB形成和培养过程中,使用机械法处理克隆有以
下好处:

a.比酶消化法形成EB的效果要好。因为机械法处理克隆以后,细胞本身就是以
小细胞团的形式存在,这一过程减少了单细胞需要先聚集成小细胞团后再形成EB 的过程。 b.减少了外源细胞的污染。由于挑取克隆的过程中,除了克隆本身生长所接触的 小鼠成纤维细胞外,挑取后很少附带其它细胞,一定程度上减少了一些动物污染。 c.易于控制EB形成的数量以及接种的细胞密度。一般来说,通过机械法所得到 的克隆切片,接种培养后第二天就可以看到成EB状的边缘清楚的小细胞团,而且 形成的EB数量直接跟接种的克隆切片数量成正相关。一般来说,接种的切片数量 尽量控制在15.20块之间,如果数量过多的话(>30块),营养成份消耗快,会直 接影响EB的发育。 2、Bmp4对hES细胞造血分化的作用BMPs是TGFl3超家族当中的多功能生长 因子,包括BMP一2、3、4、5、6、7【76,77]。*几年,BMPs成员被广泛应用于

胚胎发育和细胞功能的研究。通过研究信号转导发现,另一个家族一Smad家族当
中的Smadl、Smad5和Smad8为BMPs受体的直接结合分子,它们在BMPs信号 转导过程中起着重要的作用,提示SMADs和BMPs在发挥生物学效应过程中紧密 相连【78】。目前,有许多关于Bmp4能够促进hES细胞造血分化的报道。我们通过 初步探讨,发现它能够显著促进造血分化,造血干细胞的分化效率大概为常规细 胞因子的两倍。

胚胎干细胞建系及造m分化潜能的研究



图四







图l显徽镜下hlF璐l的克睡形态及机械法分割克隆
A:hBSI的克隆形态
IOOX

B和c分别为机械切割后的型态B:l∞x;C:200X



淄 糜 鐾

鼍褂≮豢’蛰毒

薹:垡≤:薹兰塑

胚胎干细胞建系厦造血分化潜能的研究

图2克隆分割后EB的形成以及胶原酶消化后的培养情况
A:机槭法分割后刚接种时的细胞团形态;B:为A培养48个小时后的EB形态;C:为用胶 原酶处理后?用70tim细胞筛过筛以后刚接种上的情况;D:为C培养至第6夭的情况。A、


100X:C、D

40X



图3培养至第12天各组EB的形态200X标尺=200urn
A:Bmp4组(镜下为几个EB粘连在一起).B Cytokine组;c:Cormol组(无添加细胞囚子)




图4造血集落形态及涂片
k掘合型造血集落;B:油镜下观察到的幼稚红细胞形态

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

第二部分

小结

1、NT-ES细胞可能会因为核移植而导致某些基因发生改变(常见的如印记基因 H19、Igf2等),但从我们的实验结果可以看出,它与F-ES细胞几乎一样具有 正常的体内外造血分化潜能。 2、在人类胚胎干细胞造血分化过程中,Bmp4能够显著促进造血干细胞的增殖。 3、在髓形成和培养过程中,机械法比酶消化法形成EB的效果要好;易于控制EB 形成的数量以及接种的细胞密度.

全文小结

1、我们建立了2株129/oG2 ES细胞系,而且完全符合胚胎干细胞的特性,这为 下一步造血分化提供了原材料。 2、从一些重要全能性标志物的检测来看,phES细胞都表达阳性,这与正常的hES 细胞没有明显区别。但从我们检测畸胎瘤的结果来看,这株phES细胞的体内 分化能力明显比正常的hES细胞弱。这种全能性的减弱可能是由于核型异常所 导致的。 3、NT-ES细胞可能会因为核移植而导致某些基因发生改变(常见的如印记基因 H19、Igf2等),但从我们的实验结果可以看出.它与F-ES细胞几乎一样具有 正常的体内外造血分化潜能。 4、在人类胚胎干细胞造血分化过程中,Bmp4能够显著促进造血干细胞的增殖。 5、在hES细胞的造血分化过程中,机械法比酶消化法形成EB的效果要好;易于 控制EB形成的数量以及接种的细胞密度。

胚胎干细胞建系及遣血分化潜能的研究

参考文献

1.GAIL R MARTIN.Isolation of medium conditioned



pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in stem cells.Developmental Biology,1981 78

by

teratocarcinoma

7634—7638. 2.Iames

A.Thomson.Embryonic

stem cell lines derived from human blastoeysts.Science,1 998

282:’l 145.1147. 3.Austin SmitK Cell therapy:in search ofpluripotency.Current biology,1998 8:802?804 4.Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell,2006 1 26:652-655. 5.Alexander Meismer,Marius Wcmig,Rudolf Jaenisch.Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent sta'n cells.Nature

Biotechnology?2007 25:1177?1181

6。Carsten Strnbing,Gudrun Ahnert—Hilger.Differentiation of pluripotent embryonic stc匿n cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.Mechanisms ofDevelopment,1 995 53:275-287. 7.Gerard Bain,Daniel Kitchens,Min Yao.Embryonic Stem Cells Express

Neuronal

Properties in

Viu-o,Developmental

Biology,1995 168:342-357.

8.Robert Passier,Christine Mummery.Cardiomyoeyte differentiation from embryonic and adult stem cells.Current

Opinion

ill

Bioteclmology,2005

16:498-502. molecules that enhance

9.Hesham Sadek,Britta Harmack,Elizabeth Choe.Cardiogenic small myocardial repair by stem cells.PNAS,2008 105:6063--6068

lO.Zulewski 14_Differentiation of embryonic and adult stca'n cells into insulin producing cells. Panminerva Meal,2008 50:73-79. 1 1.Henryk Zulewski.Stem cells with potential to generate imulin-producmg cells in man.Swiss

Med Weekly,2006 136:647-654.
1 2.Kappas NC,Bautch VL.Maintenance and in vitro
to

differentiation

of mouse embryonic stem ceils

form blood vessels.Curt Protoc Cell Bid,2007 Chapter 23:Unit 23.3 Golunski.In vitro generation of hematopoietic
St.℃WII

13.Ronald Palacios,Eva embryonic stem cell

cells

from

all

line.Developmental Biology?1

995 92:7530-7534

14.Kim K.Recombination signatures distinguish embryonic Stelll cells derived
7I

by

parthenogenesis

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

and somatic cell nuclear transfer.Cell Stem Cell.2007 13:346—352. 15.Revazova ES.Patient-specific stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocyscs. Cloning Stem Cells,2007 9:432-449.

16?Mai Q.Derivation

of human embryonic stem cell lines from

p砒hcnogen。tic blastocym.Cell

R伪,2007 17:1008.1019.

17.Doetschman T,Eistter H,Katz M,et a1.The in vitro devdopmont of blastocyst derived
embryonic stellq lines:formation ofvisceral yolk SaC,blood islands and myocardium.J Embryol

ExyMorphol,1985
18.Keller G Kennedy

87:27-45.



Papayannopoulou T,et a1.Hematopoietic commitment during embryonic

stem cell differentiation in

culture.Mol Cel

Biol,1993 13:473-486.

19.Palacios R Golumki E,Samaridis J.In vitro generation of

hematopoietic

stem cells from锄

embryonic stem cell line.Proc Nat/Acad,1995 92:7530.7534.
20.Hong

Wang
to

Jennifer B.Gilner,Victoria L.Bauteh,et

a1.Wnt2

Coordinates the Commitment of

Mesoderm

Hematopoietic,Endothelial,and

Cardi∽Lineages in Embryoid Bodies.Biol Chera,

2007 282:782.791. 21.Kristina C.Pfendler,Carmina s.Catuar,et a1.Overexpmssion ofNodal Promotes Differentiation of

Mouse

Embryonic Stem Ceils into

Mcsoderm and

Endodcrm at the Expense

of Nouroectodorm

Formation.Stem Ceils and Development,2005 1 4:1 62-1 72.

22.Masanori Takonagal,Miki Fukumoto,Yuichi Hori.Regulated Nodal signaling promotes

differentiation

of the definitive endoderm and mesoderm from ES

cells.Cell Science,2007

120:2078.2090. 23.Cheryl D.Helgason,Guy Sauvageau,et stem of HOXB4 in

a1.Overexpression

enhan溺the

hematopoietic 87:2740.2749.

potential

of锄nbryomc

cells differentiated

vitro.Blood,1 996

丝Jan Jacob

Schuringa,Kaida

Wu.et

a1.Enforced activation of STAT5A facilitates the generation cells that contribute to

of embryonic stem--derived

hematopoietic stem

hematopoicsis

in vivo.

Stem Cells,2004 22:1191.1204.

25.Jonice D.Costa,Alan D.Friedman,Curt I.Civin.Enforced RUNXl Expression Increased the
Numbers

OfCD24+and

CD45+Cells from Human Embryonic Stem Cell-Derived Embryoid

Bodies.(ASH Annual Meeting Abstracts)Blood,2006,1 08.
72

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

26.Jesse

J.Lugus,Y瑚Shin

Chung.GATA2

Rmotions at multiple

steps

in

hel】豫n西oblast

development md differentiation.Developmera,2007 1 34:393-405 27.Naruyoshi Suwabe,Satoru Takahashi。GATA-1 Regulates Growth and Differentistion of 92:

Definitive Erythroid Lineage Cells During In Viu-o ES Cell Differentiation.Blood,1998 4108_41 18。 28.Brag L缸Yanxun Sun,Feizi Jiang,et proliferation of a1.Disruption of Smad5 gene precursors during

leads to enhanced hematopoiesis.

high-proliferative

potential

embryonic

Blood,2003 101:124-133. 29.Claudia Lengerke,Sabine Schmitt,George Q.Dale),.BMP and

Wnt

Specify hematopoietic fate

by∽-tivation ofthe Cdx-Hox pathway.Cell Stem
30.Atsuhiko T.Naito,Ichiro

Cell

2008 2:72-82. stage?specific biphasic roles of

Shiojima,ct

a1.Developmental

Writ/一一cateninsignaling

in cardiomyogenesis andhematopoiesis.PNAS,2006 103:19812-19817


31.Suzuki八Nakano T.Development of hematopoietic cells from embryonic stem cell.女.Int
Hematol,2001 73:1-5. 32.Conley BJ’_Denharn Human Embryonic

MGulluyan L,et
Stem Cell

a1.Mouse embryonic stem cell derivation,and Mouse and
and

Culture

Differentiation

as

Embryoid Bodies.Cell

Biology,2005 23:trait 23.2. 33.Georges

Lacand,Lia Gore.Runxl

is

essential

for

hematopoietic

commitment缸the

hemangioblast stage ofdevelopment in vitro.Blood,2002 100:458-466 34.Tsukasa

Miyagi,Mitsuhiro Takcno.Flk-1+cells
hematopoiesis in vivo in SCID

derived from mouse embryonic stem cells

reeomtitute

mice.Experimental

Hematology,200"2-

30:14舡卜1453. 35.Jan Jacob Schuringa.Enforced Activation of STAT5A Facilitates the Generation of Embryonic Stem-Derived Hematopoietic Stem 2004 22:1

Cells That

Contribute to Hematopoiesis In Vivo.Stem Cells,

191-12啦

36.Ivan N.酗ch.Primordial Germ celIs Are Capable of Producing Cells of the Hematopoietie System In Vitro.Blood,1 995 86:463-472. 37.Ohtaka T.Hcmatopoietic development of primordial germ cell—derived mouse ernb叮onic germ cells in culture.Biochem Biophys Res Commtm,1999 260:475-482 38.Dan S.Kaufinan.Hematopoietic colony—forming cells derived from human embryomc stem cells.

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

PNA¥,2001 98:10716-10721. 39.Caihorlg Qiua,Eric Hal丝oiz Differentiation of human embryonic stem cells into hematopoietic cells by coculture with human fetal liver cells recapitulates the globin switch that development Experimental Hematology,2005 33:1 450-1 458. 40.nan
OcctLrS

cEly in

Wang,Hui-Ping Zh∞.In vitro hematopoietic differentiation ofhuman

embryonic

stem cells

induced by co-cultttre with human bone marrow stromal cells and low dose cytokines.Cell Biology International,2005 29:654.661.

41.KaOa C.Weisel,ving@ao.Stromal
potent supporters of routine 34:1505--15 16. 42.Kristin Chadwick,Lisheng

cell lines from the

aorta-gonado-mesonophros region

are

and human
?

hematopoiesis.Experimental

Hematology,2006

Wang.Cytokines and BMP-4 promote 102:NUMBER
3.

hematopoietic diffcrmfiation

ofhuman embryonic stem
43.Maljorie
Pick

cells.BLOOD,2003

Differentiation of Human Embryonic Morphogenetic

Stem Cells in Semm-Free Medium Reveals

Distract Roles for Bone

Protein 4,Vascular Endothelial Growth Factor,Stem

Cell

Factor,rod Fibroblaat

Growth Factor

2 in

Hematopoiesis.STEMCELLS,2007

25:2206-2214.

44.Morel F,Galy A

Equal dislribufion of competitive long-term repopulating stem cells in the ofThy—llowLin-/lowScaol+bone marrow cells.Exp HematoLl998

CD34+and CT)34-fractions 26:4404勰.
45.Case

J,Mead

LE.Human CD34+ACl 33+VEGFR-2+ceHs are not endothelial progenitor ceHs

but distinct,primitivehcmatopoicticprogenitors.ExpHcmatoL 200735:1109.1118.

46.Mickie

Bhatia.Hematopoiefic Development from

Hul:nan

Embryonic Stem Cells.Hematology

2007,meeting. 47.Lisheng

Wang.Hematopoictic

development from

human embryonic stem cell lines.Experimental human embryonic stem cells

Hematology,2005 33:987-996. 4s.Shi-Jiang Lu.CD34+CD38一hematopoietic precursors derived from exhibit
an

embryonic gene expression pattern.Blood,2004 103:4134-4141.

49.Kristina Detmer.Bone morphogenctic proteins act synergistically with haematopoietic cytokines in the differentiation ofhaematopoietic progenitors.Cytokine。2002 1 7:3岳42.

50.Marshall

CI.Bone morphogcnctic protein 4 modulates c-Kit expression and

diff盯cntiation

potential in murine embryonic aorta-gonad-mesonephros hacmatopoiesis in vitro.Br J Haemat01.
74

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

2007 1 39:321.330. 51.Chantal

Cerdm,Anne Rouleau,Mickie Bhati&VEGF—A1 65

attgments

erythropoietic

dcvelopmem fromhuman embryonic stem cells.2004 103:2504-2512. 52.Anand S.Srivastava.Thrombopoietin Enhances Generation of CD34__Cells from Human

Embryonic Stem Cells.STEM CELLS 2007;25:1456-1461 53,A.Daisy

Narayan.Human
as

embryonic stem cell-derived hematopoietic cells a10 capable of

engrafting primary

well

as

secondary fetal sheep recipients.Blood,2006 1 07:21 80-21 83.

54.Jon S.Odorico,Dan

S.Kaufman,James A ThomsorL Multilineage Differentiation from Human

Embryonic Stem Cell Lines.Stem cells,2001;19;193—204. 55.Jacob Hanna.Tfeatment of Sickle CeU Anemia Mouse Autologous Skin Science,2007 31 8:1920-1923. 56.Takahashi K.Induction ofpluripotem stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell,2007 1 31:861—872. 57.Park

Model

with iPS Cells Generated from

m.Reprogramming

of human somatic cells t0 pluripotency with defined factors.Nature,

2008 451:135-6. 58.H.Ogawal,Y.One,T.Kono,et

a1.Disruption

of imprinting in cloned mou∞fetuses from

embryonic stem cells.Reproduction.2003;1 26:549-557. 59.Teruhiko nuclear

Wakayama.Production
transfer:how
to

of cloned mice and ES cells from cloning efficiency?Journal

ad眦somatic
of

cells by
and

improve

Reproduction

Development.2007 53:13?26. 60.Kellie.L.K.Tamashiro,Teruhiko Wakayama.RandaH l毛Sakai,ct a1.Cloned mice have phenotype not transmitted to their offsping.Nat Med.2002 8:262—26Z
an

ob铭e

61.Shimozawa N’One Y,Kirnoto S,Ire M,ct a1.Abnormalities in cloned mice
the progeny.Genesis.2002 34:203-207 62.Teruhiko

ale

not

transmitted to

Wakayama,A C

F Perry,1L Yanagimachi,et a1.Full-term development of mice cumulus cell nuclei.Nature.1998 394:369?373 in ES Cells and Cloned

fromenucleated OOCyteS 63.David

injected with

Humpherys,Kevin Eggan,Rudolf Jaenisch.Epigenefic Instability

Mice.Science.200l 293:95.97 64.Ogura人Inoue K,Ishino F.Phcnotypic effects of somatic cell cloning in the mouse.Cloning
Stern

Ceils.2002;4:397-405.

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

65.William M.Rideout

III,Ke ̄,in Eggan,Rudolf Jacnisch.Nuclear Cloning and Epigenetie

Reprogramming ofthe Ge(=nome.Science.2001 293:1093—1098.

66.Mann佩Chun¥YG'Nolen

LID,醴a1.Disruption of imprinted gene methylation and

expression in cloned preimplantation stage moL毽e embryos.Biol Reprod.2003 69:902-914. 67.Jian-Er Long,Xia Cai.Igf-2r expression regulated by epigenetic modification and the locus of gene imprinting disrupted in cloned cattle.Oone.2007;388:125一134. 68.Suemizu H'Aiba



Yoshikawa T'et a1.Expression profiling ofplac圮ntomegaly associated with

nucleartransplantation ofmouse ES cells.DecBiol;2003 253:36--53. 69.Brambrink T'Hochedlinger blastocysts are



Bell G'et a1.ES cells derived from and functionally

cloned and fertilized Acad.2006

transcri砸onally

indistinguishable.Proc Nail

103:933.938.

70.Wakayama

S,Jakt ML,Suzuki

M et a1.Equivalency

ofnuclear tra璐fer-derived embryonic stern

cells to those derived from fertilized mOl,li潞blastocysts.Stem Cells,2006 24:2023-2033. 71.Tiziano Barberi,Peter Klivenyi,Noel Calingasan ete..Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in

parkinsonian mice.Nature

Biotechnology.2003 21:1200-1207. 72.Yeom YH,Fuhnnann G,Ovitt CEet a1.G-ermline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle ofembryonal cells.Development,1996 122:881-894. 73.Szabd PE,HQbner



Sch61er H.et a1.Allele-specific

expression

of imprinted genes in mouso

migratory primordial germ

cells.Meeh

Dev,2002 115:157-160.

74.Cunlano A,Dieterlen-Lievre EOodin I.Lymphoid potentialprobed before circulation in mouse,is restricted to caudal intra-embryonic

aplanchnopleura.Cell,1996

86:907.916.

75.Dongho Choi,Hye-Ja Lee,Seunghyun Jee,et a1.In Vitro Differentiation of Stem Cells:Eraichment 23:81 7.827. of

Mouse

Embryonic Cells,2005

Endodermal

Cells

in

the

Embryoid Body.Stem

76.Wozney/M.Bone morphogenetic proteins.Prog
77.Chela D.Bone morphogenctie

Growth Factor Res.1989 1:267.280。

proteins.Growth
act

Factors.2004 22:233.241.

78.Yamarnoto N.Smadl and smad5

downstream of intracellular signalmgs of BMP-2 that

inhibits myogenic differentiation and reduces osteoblast Biochern

differentiation

in C2C1 2 myoblasts.

Biophys

Res Commun.1997 238:574-580.

76

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

创新点

l、首次利用NT-ES细胞进行造血分化的探讨,并基本阐明了NT-ES细胞与F-ES 细胞在造血分化过程中的异同. 2、根据人类胚胎干细胞的特性,利用机械法取代酶消化法处理细胞克隆后进行分 化培养,既能够提高EB的形成效率,也减少了动物源性的污染。

今后工作重点

1、完善造血分化体系,将胚胎干细胞的致瘤性消除或降到最低。 2、将工作重点移向人类胚胎干细胞造血分化的研究,希望能通过研究与临床紧密 结合起来,为探讨人类*疾病做出贡献。

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

综述
拟胚体形成过程与小鼠胚胎干细胞造血分化的关系
黄盛昌孙筱放审校

摘要在胚胎干细胞(Embryonic
(Embryoid

Stem CeIIs,ES

cells)造血分化过程中,拟胚体

Bodies,EBs)起着非常重要的作用。它模拟体内胚胎发育过程,能够

形成外胚层、中胚层和内胚层三个胚层。目前拟胚体培养方法较多,最为理想的 可能是通过旋转生物反应器培养,因为这种方法形成的拟胚体之间形态大小都具 有比较好的一致性。拟胚体的造血调控机制与体内基本相似,主要通过Wnt、BMP 和Notch等信号旁路调节;基因Hoxb4、Stat5a、runxl等过表达对造血也有影响。 不断完善拟胚体的造血培养过程,相信能够更好地促进对胚胎干细胞造血分化的 研究. 关键词:胚胎干细胞;拟胚体;造血作用;诱导分化

The Relationship Between Mouse Embryonic Stem Cells and Embryoid Bodies During Hematopoietic Differentiation HuangShengchang Abtract Embryoid SunXiaofang role in hematopoietic differentiation

Bodies(EBs)play 81"1 important ceils).EBs

of embryonic stem cells(ES
can

simulate the development of embryos,and they

form three embryonic layers,including ectoderm,mesoderm and endodemLThere 81"0

many culture methods to form EBs.At present,rotary bioreactor is known to be the best
one

probably because EBs cultured by it
are

are

highly homologous in morphology and size.

EBs

quite similar with

embryos

in the regulation of hematopoiesis.Some signaling

patheways regulate the process of EBs’hematopoiesis,including etc..Additionally,EBs’hematopoiesis is also

W她BMP and Noah
as

regulated

by some genes,such

Hoxb4,Stat5a,mnxl etc..Obviously,it will be much helpful for the differentiation of ES
cells in hematopoietic differentiation by improving the EB

formation and development

Key words:Embryonic stem c宅lls,Embryoid bodies,Hematopoiesis,Differentiation

胚胎千细胞建系及造血分化潜能的研究

l、正常胚体造血发育与拟胚体造血发育的关系 拟胚体又称为类胚体,通常是指胚胎干细胞在体外发育成类似于早期胚胎的, 包括内中外三个胚层的球状结构。除胚胎干细胞外,胚胎生殖细胞(Emb碍omc cell,EGc)、可诱导多能性干细胞(Inducible
Pluripotent Stem germ

cell,iPS)【lJ等也可以形

成EBs。早期发育的简单EBs包含了原始内胚层和原始外胚层,这些结构与胚胎 发育过程中卵圆柱期(Egg Cylinder)的结构相似:随着简单EBs发育成熟,形成 包含了内中外三个胚层的囊状EBs。由于EBs三个胚层的形成与分化可以模拟体 内胚胎早期发育过程,因此常常被作为哺乳动物胚胎发育、胚层之间相互作用以 及胚层定向分化等现象的体外模型【21。 1.1小鼠胚胎的造血发育 原肠胚(Gastrula)在胚胎发育到第6天形成,原肠作用(Gastrlation)在第6.5天左 右发生。原肠作用是使第6天呈双层细胞结构的胚胎发育为多层细胞结构。这时从 胚胎表胚层(Epiblast)发育过来的原条(Primitive Streak,PS)开始形成,中胚层在原 条的两侧形成并慢慢展开。位于原条前端区域的中胚层细胞迁移至胚胎体内,形 成相应的衍生物,其中包括主动脉.性腺.中’肾区(aorta.gonad.mesonephros,AGM); 位于原条后端区域的中胚层细胞向附*迁移,形成绒毛、羊膜、尿囊和卵黄囊【3J。 胚胎发育到第7.5天时,造血开始发生,最先出现的地方是在卵黄囊的血岛【2列。卵 黄囊造血开始于胚胎发育的第7.5天,结束于第12.5天,包括原始造nm(Primitive Hematopoiesis)和永久造血(Definitive Hemotopoiesis),早期以原始造血为主;主 动脉.性腺.中肾区是另一个早期产生造血细胞的地方,以永久造血为主,它在胚胎 发育的第8.5天发生造血,结束于第12.5天,产生的造血细胞经过迁移到达肝脏进 行胎肝造血;胚胎发育至第11天才发生胎肝造血,而骨髓造血在第15天左右才开 始‘40’。胎鼠出生后,胎肝造血慢慢退化,进而由骨髓造血取代其它造血(见图1)。 造血细胞和血管上皮细胞被认为是最早分化出来的细胞,原因是机体需要先建立 一个*循环系统供机体生长发育的需要【6】。

Ⅱ*十自寞毫幕厦造t分化糟如的研R

圈1小鼠胚胎造血发育过程(来自文献【51)

不过最*c晡呦ph盯Thomas Lax等提出一些新的看法,他们研究认为胚胎发育
至第10天前的造血细胞,不管是原始的还是永久的,都是来自卵黄囊”’。原因是 在他们对胚胎中的Ncxl基因进行藏除后,胚胎的心脏因发育*挥刑 环系统也没有*的流动.但胚胎仍然能够发育到第lO天。这时检剽Ncxl4胚胎 中造血细胞,发现与正常胚胎的数量没有区别.McC,rv曲和Palis J认为不管是卵黄

囊还是A矧慵血.都以红系造血为主”一1,这与上述观点相一致。
1.2拟胚体的造血发育 茸前就EBs的发育还有很多方面没有研究清楚.如各胚层如何分化发育成熟、EBs 发育到什么时候进行下一步分化最为合适、在分化过程中各胚层之间的相互作用 如河以及基因调控的基础等等。下面主要从形态发育上进行讨论: 目前在形态上评价EBs发育良好程度一般以形成腔体的为好,但非人灵长类Es 细胞发育而来的EBs通常不形成腔体01.而小鼠的和人娄的EBs在体外发育判一定 阶段都台形成结构比较典型的腔体n0’.腔体的太小会园发育的时间和程度而有所 区别。通常将EBs的发育过程分为两个阶段t简单EBs和囊状EB¥.发育2_4天的EBs,

其形态象桑椹胚.为多个髓细胞聚集在一起或由单十Es细胞发育起来的球状结构.
称为简单拟胚体;发育5.7天后,中央出现囊腔结构.称为囊状拟胚体。囊状毅旺 体与胚胎发育至原肠胚期或卵圆柱期的阶段相类似。当EBs发育至8.10天后.腔体 变大.各胚层发育成熟.此时与卵黄囊的发育阶段相类似”’’Ⅲ.本人认为,在分 化过程中可以根据上面情况对EBs划分成三种类型进行计数t 1、简单EBs的计数, 在第3.4天进行。以形成肉眼可见的球状结构为判断标准。2、囊状EBs的计数。在 第5-7天进行,以中央形成腔体为判断标准。3、成熟囊杭EBs的计数,在8-12天进 行.以整个EBs形成透亮壁薄的腔体为判断标准.一般来说.在同一条件下.如果 囊状和成熟拟胚体数量越多,说明这一细胞株的体外发育更为良好。

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

在造血培养过程中,EBs培养至囊状阶段时,在胚体的中心往往会形成以原始红 系前体细胞为主的略带深黄色的血岛,而且在EBs的周围会出现一些以粒细胞和巨 噬细胞为主的向四周扩散的细胞,使整个EBs呈放射冠状,称为造血拟胚体[131。 造血拟胚体的出现说明造血分化处于一个活跃的阶段,可以用它来作为评价EBs 造血活性的一个指标。 Choi等将未分化的ES细胞和分别培养了1至6周的EBs进行基因表达水*的比较, 发现不同胚层之间的基因表达水*发生很大的变化114,1"。Keller等‘161发现血清对 三个胚层的发育有重要的影响。将经过6天有血清培养和接着3天无血清培养的EBs 进行各胚层基因表达水*的比较,发现在加有血清培养的EBs里,中胚层和外胚层 基因根据发育程度可以呈现出不同程度的表达,但转到无血清培养基中后,促进 了内胚层发育的同时,中胚层和外胚层的基因却受到不同程度的抑制,甚至不表 达。所以,如果要进行与内胚层分化有关的培养,最好在EBs培养过程中转至无血 清培养基中,而中、外胚层的分化则需要血清的支持。 1_3联系和区别 1.3.1联系EBs在发育过程中能够形成三个胚层,与体内发育过程相一致;EBs具 有向三个胚层进行定向分化的能力,这也与正常胚胎的发育能力一致。所以,利 用EBs作为一种体外模型来研究胚胎发育过程具有一定的前景。 1.3.2区别EBs的分化过程毕竟是模拟体内的发育过程,难免会出现一些不稳定因 素:l、培养条件差异。就目前来说,不同的实验室,不同的人进行造血分化,其 实验条件、细胞因子的使用浓度和种类以及人员的能力素质等都影响实验结果, 然而胚胎在体内的发育过程相当稳定,不会受到诸多不稳定因素的影响。2、胚胎 在体内发育分化的时间要比EBs的快。有学者对全能性基因OCT4的表达水*进行 检测发现,从未分化的ESN分化至第6周的EB.都表达OCT4,但表达量在逐渐降 低;同时,他们也检测了第16.5天的胎肝.发现已经不表达OCT4[141,说明胚胎在 体内发育比EBs在体外发育快的多。 2、拟胚体培养方法对造血分化的影响 EBs的形成通常是将ES消化成单细胞或小细胞团,去除抑制分化的培养成分, 如LIF、bFGF等,在悬浮培养条件下培养一段时间后形成的。在诱导分化过程中 往往都需要形成EBs这一阶段,形成EBs的关键是防止细胞贴壁生长,同时促进 其分化。目前EBs培养方法比较多,形成EBs的效率、发育程度以及分化能力都
8l

胚胎干细胞建系及造血分化潜能的研究

有一定的差异1171。根据实际情况,选择适合自己实验目的的培养方法来进行诱导 分化是至关重要的。下面介绍几种常用的培养方法: 2.1悬滴法悬滴法是一种较早采用而且广为使用的EBs培养方法。通常将每个液 滴的ES细胞数调整为400.1000个,过低和过高都不利于EBs的形成‘17’1鄹;然后 在petri dish的盖子上整齐的加上液滴,每个液滴的含量为20-30ul,最好不要超过 50ul;向petri dish中加入适量的PBS,防止培养液在培养过程中过渡挥发.最后 将加有液滴的盖子轻轻倒转过来置于皿上,形成悬滴u".ES细胞在重力作用下在 液滴的底部聚集成团。通常在悬滴里培养2-3天后。转到悬浮培养液里进行进一步 的培养分化。该方法得到的EBs之间形态较为均一,而且能够控制形成的数量, 但存在形成的EBs数量有限、操作繁琐、易受外界因素影响而使实验结果不稳定 等不利因素。 2.2悬液法悬液法与悬滴法相比操作更为简单,通常向直径为10cm的低吸附培 养皿(如Petri dish、超低吸附培养皿或普通细菌培养皿等)中加入10rid的分化培养 液,并调整ES细胞密度为103-106/ml 1123。悬液培养与悬滴培养相比较,EBs之间的 大小和形态更加不规则,数量波动大(181,但它操作简便,各基因的表达水*与后 者没有差异,所以也被广范应用。 2.3半固体培养法常用甲基纤维素与细胞悬液配成O.9%的半固体培养基,调整 细胞密度为1-5x103/ml,然后接种2ml-3ml培养基到直径为35ram的Petri
dish[201。

胚胎干细胞在这种半固体的悬浮状态下生长,显著减少了贴壁,有利于EBs的形 成。Daley等通过比较认为,悬液培养法和半固体培养法两者在EBs形成的数量上 具有相似的趋势,而且通过动态检测造血干细胞的含量以后,认为两者在造血分 化过程中没有明显的区别m1。 2.4促凝集法促凝集法是最*几年才发展起来的拟胚体培养方法。Elizabeth
S.

Ng‘加’和Burridgef‘21’等分别报道了将胚胎干细胞处理成单细胞,用无血清培养基 (SFM)将一定数量的ES细胞种植在V型或圆底U型超低吸附的96孔板里,通 过离心将孔里的细胞聚集成小团,10.12天后再将形成的EBs转种到另一个预先用 明胶铺好的*底96孔板中贴壁生长,进行下一步分化。这种通过离心力的作用所 形成的EBs更易于控制大小和数量,培养出来的EBs在形态、大小以及发育程度 上与悬滴法相比更具有一致性。

Ⅱ∞十目磨建景&遣^丹化潜能∞日究



5微囊法应用高压脉冲静电液滴发生器,常用藻酸盐或璩腊糖作为介质产生i葭

滴微囊.微囊包被一定量的胚胎千细胞.胚胎千细胞在微囊中分

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